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中南民族大学 药学院 化学生物学教研室 尼龙固定化木瓜蛋白酶 化学生物学实验 1.实验目的 化学生物学实验 6学时 1 2 学习尼龙固定化木瓜蛋白酶的原理和方法。 掌握共价结合法固定化酶的原理和方法。 中南民族大学 药学院 化学生物学教研室 2.实验原理 化学生物学实验 6学时 1 2 3 4 酶不与产品混合，制品易于纯化。 在大多数情况下，可提高酶的稳定性。 提高酶的使用效率，降低生产成本。 利用固定化酶，工业上可以大批量、连续化生产 定义：通过物理或化学的方法，将水溶性的酶与水不溶性载 体结合，使酶固定在载体上，并在一定的空间范围内 进行催化反应的酶称为固定化酶。 固定化酶的优越性主要表现在： 2.实验原理 化学生物学实验 6学时 包埋法 共价键 结合法 交联法 酶的固定化方法有： 吸附法 (物理吸附、离子吸附) 1 2 3 4 2.实验原理 化学生物学实验 6学时 本实验尼龙固定化木瓜蛋白酶属共价键结合法。尼龙长链中的酰胺键 经HCl水解后，产生游离的-NH2基，在一定条件下与双功能试剂戊二醛 中的一个-CHO基缩合，戊二醛中的另一个-CHO基则与酶中的游离氨 基缩合，形成尼龙(载体)-戊二醛(交联剂)-酶，即尼龙固定化酶。 —[NH(CH2)6NHCO(CH2)4CO]n— HCl ~R-CH2-NH2 OHC-CH2-CH2-CH2-CHO ~R-CH2-N=CH-CH2-CH2-CH2-CHO 目标产物 3.实验材料、试剂及仪器 化学生物学实验 6学时 材料 (1)尼龙布(86或66)，140目，剪成3 cm×3 cm大小的方块 (2)吸水纸 仪器 (1)恒温水浴锅 (2)紫外分光光度计 (3)冰箱及玻璃器皿 中南民族大学 药学院 化学生物学教研室 3.实验材料、试剂及仪器 化学生物学实验 6学时 (1)18.6% CaCl2溶液 (2)甲醇溶液 (3)3.65 mol/LHCl溶液 (4)0.2 mol/L硼酸缓冲液(pH值8.5) (5)5%戊二醛溶:用0.2 mol/L,pH值8.5的硼酸缓冲液配制 (6)0.1 mol/L硼酸缓冲液(pH值7.8) (7)1 mg/mL木瓜蛋白酶溶液 (8)0.1 mol/L磷酸缓冲液(含3% NaCl) (pH值7.2) (9)0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2) (10)激活剂：用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制，内含 20 mmol/L半胱氨酸、1 mmol/LEDTA的混合液。 (11)1%酪蛋白溶液：用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制。 (12)10%三氯乙酸(TCA)溶液。 主要试剂 4.实验步骤 1、固定化酶的制备 (1)每组取5块尼龙布洗净、晾干，浸入10 mL混合液（取1.86 mL 18.6%CaCl2溶液加入8.14 mL甲醇溶液中，注意要现配现用） 中10s左右，取出后用水冲洗 、干净，用吸水纸吸干。 (2)尼龙布用3.65 mol/L HCl溶液在室温下水解45min，用蒸馏水 冲洗三次至pH中性。 (3)将尼龙布用5%戊二醛溶液在室温下浸泡偶联20 min。 (4)取出尼龙布，用0.1 mol/L 磷酸缓冲液(pH值7.2)反复洗涤， 洗去多余的戊二醛，吸干之后，立即用酶液(0.5～1 mg/mL)在 4℃下固定3.5 h(酶液用量每块尼龙布不宜超过0.8 mL)。 (5)从酶液中取出尼龙布(保留残余酶液作测定用)，用 0.5mol/LNaCl溶液(用0.1 mol/L，pH值7.2的磷酸缓冲液配制)洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。 化学生物学实验 6学时 4.实验步骤 化学生物学实验 6学时 2、酶活力测定 (1)溶液酶活力测定：取0.2 mL酶液，加入2.3 mL激活剂，于 37℃ 下预热10min，加入37℃预热的1%酪蛋白溶液mL， 准确反应10 min，然后加入10%三氯乙酸溶液1.5 mL终止 酶反应。对照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶 液，其他与测定管相同，以8000 r/min的转速离心10 min或 过滤，取其上清液于波长280 nm处测定吸光度。在上述条 件下，每10 min增加0.001个吸光度为1个酶单位(U)。 (2)残留酶活力测定：方法同溶液酶活力测定。 (3)固定化酶活力测定：取一块尼龙布固定化酶，加入2.5mL激 活剂，其余