实验八线粒体的分离与观察.doc

实验八 线粒体的分离与观察 教学目标：掌握。。 五．教学内容: 实验原理 制备线粒体采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心。 在一给定的离心场中，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种cell器及其它内食物，由于沉降速度不同将停留在不同的位置。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性。 线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法，詹纳斯绿B是对线粒体专一的活细胞染料毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由此吸引堆积在线粒体膜上，线粒体 cell色素氧化酶，使该料保持在氧化状态，呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。 实验步骤 1．匀浆:取1g肝细胞，剪碎，加9ml、0.25ml/L缓冲蔗糖液匀浆 先加2ml匀浆, 匀浆后再加7ml ，双层尼龙布过滤于10ml试管中备用。 2．差速离心：取1ml 0.34mol缓冲蔗糖液于2ml刻度离心管中 用滴管加至1ml刻度即可 ，然后沿管壁小心加入肝匀浆，约0.5ml覆盖于上层，700×g 3000rpm 离心10分钟，弃沉淀取上清液，10000×g 12000rpm 离心10分钟，沉淀为线粒体。 3．染色：取线粒体沉淀涂片 注意勿太浓密 不待干即min。 4．观察：盖上盖玻片，显微镜观察。（线粒体蓝绿色，呈小棒状或亚铃状。） 实验结果 线粒体蓝绿色，呈小棒状或亚铃状。 结果讨论 六．课堂小结 根据学生的实验结果进行总结。 如果使用不带冷冻控温的普通高速离心机操作，应尽量缩短操作时间、注意样品的冷冻，保持其生理活性。 细胞生物学实验教案 邵邻相 2