实验一DNA的粗提取与鉴定.doc

分子生物学实验指导 遗传教研室编 安徽师范大学生命科学学院 2008年月 实验一 DNA的粗提取与鉴定 [目的要求] 学会DNA的粗提取和鉴定的方法，观察提取出来的DNA物质。 [实验原理] DNA在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氯化钠的浓度变化而改变的。当氯化钠的物质的量浓度为0.14mol/L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在氯化钠溶液中的DNA析出。 DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。 DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。 [实验仪器与设备] 1. 铁架台 2. 玻璃棒(1个) 3. 滤纸 4. 量筒（100ml，1个） 5. 烧杯 1个 6. 试管（20ml，2个） 7. 漏斗(1个) 8. 试管夹(2个) 9. 纱布(15块) 10.离心机(1台) [实验材料] 1. 鸡血细胞液（5ml10ml） 2. 95%乙醇（预冷24h） 3. 蒸馏水 4. 柠檬酸钠(质量浓度0.1g/ml) 5. 氯化钠(2mol/L和0.015mol/L) 6. 二苯胺 7. 高氯酸 8.乙醛 9. 冰乙酸 [实验步骤] 实验前需要制备鸡血溶液，制备的方法是：取柠檬酸钠的质量浓度为0.1g/ml的溶液（抗凝剂）100ml，置于500ml烧杯中。将宰杀活鸡流出的鸡血（约180ml）注入烧杯中，同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸钠溶液充分混合，以免凝血。然后，将血液倒入离心管内，用1000rpm离心2min，此时血细胞沉淀于离心管底部。实验时，用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液（如果没有离心机，可以将烧杯中的血液置于冰箱内，静置一天，使血细胞自行沉淀）。 提取鸡血细胞的细胞核物质 将制备好的鸡血细胞液5ml10ml，注入到50ml烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20ml，同时用玻璃棒充分搅拌5min，使血细胞加速破裂。然后，用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500ml的烧杯中，取其滤液。 2． 溶解细胞核内的DNA 将氯化钠的物质的量浓度为2mol/L的溶液40ml加入到滤液中，并摇动烧杯，使其混合均匀，这时DNA载溶液中呈溶解状态。 3． 析出含DNA的粘稠物 沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量的浓度相当于0.14mol/L）。 4． 滤取含DNA的粘稠物 用放有多层纱布的漏斗，过滤步骤3中的溶液至500ml的烧杯中，含DNA的粘稠物被留在纱布上。 5． 将DNA的粘稠物再溶解 取1个50ml烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为2mol/L的溶液20ml。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃棒不停地搅拌，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中。 6． 过滤含有DNA的氯化钠溶液 取1个100ml烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液，DNA溶于滤液中。 7． 提取含杂质较少的DNA 在上述滤过的溶液中，加入冷却的、酒精的体积分数为95%的溶液50ml（使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳），并用玻璃棒搅拌，溶液中会出现含有杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA。注意观察丝状物是什么颜色。 8． DNA的鉴定 取两支20ml的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为0.015mol/L的溶液5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。将观察的结果填写在《实验报告册》上。 [作业] 1.步骤8的2支试管中溶液颜色的变化说明了什么?将得出的结论填写在《实验报告册》上。 2．提取鸡血中的DNA