动物生物化学实讲义.doc

实 验 讲 义 （霍金龙老师） 实验一 实验基本知识与基本操作，血液样品的处理及组织匀浆的制备 实验二 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 实验三 琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察 实验四 血液葡萄糖的测定（福林—吴宪氏法）（紫外吸收法）全血基因组DNA的提取（离心柱型试剂盒提取法）PCR扩增基因 即将 6mol/L H2SO4 450ml加水稀释到1080ml，则成2.5mol/L H2SO4溶液。 ②稀溶液调整为浓溶液法：仍按照溶液浓度与体积成反比的原理及交叉法计算。公式为： C（V1+V2）=c2V2+C1V1 V1=浓溶液体积 C1=浓溶液浓度 V2=稀溶液体积 C2=稀溶液浓度 C=所需溶液浓度 例：现有0.25mol/L NaOH800ml，需加多少毫升1mol/L NaOH才能使之成为0.4mol/L NaOH? 代入公式：0.4（V1+800）=0.25800+1V1 0.4V1+320=200+V1 0.6V1=120 V1=200 即加入200ml 1mol/L NaOH即可使800ml 0.25mol/L NaOH成为0.4mol/L NaOH溶液。 （4）常用酸碱的摩尔浓度计算 实验室中常用的酸Hcl、H2SO4、CH3COOH等及碱NH4OH等都是液体的，试剂瓶上标有比重、浓度（W/W）、分子量等，可以按以下公式计算出摩尔浓度： 例：求含量浓度38%（W/W），比重1.19的HCl分子量36.46的摩尔浓度是多少？ 3、操作：每人各配一个百分浓度，一个摩尔浓度的试剂 (五)离心机的使用方法 离心机是利用离心力将悬浮液中的微粒从溶液中分离出来的一种仪器。根据最高离心转速的不同可将离心机分为三种类型：普通离心机，其最高转速一般在4000转/分至6000转/分；高速离心机，转速可达10000转/分至25000转/分；超速离心机，转速可超过50000转/分以上。生化实验室常使用普通离心机。 普通离心机的使用方法： 1．使用前先检查变速旋钮是否在“0”位，外套管是否完整无损和垫有橡皮垫。 2．离心时先将待离心的物质转移到大小合适的离心管内，盛量不宜过多,占管的2/3体积为宜,以免溢出。将此离心管放入外套管，再在离心管与外套管间加入缓冲用水。 3．将一对装有离心管的外套管在台称上平衡。如不平衡可调整缓冲用水或离心物质的量。 4．将平衡好的套管，按对称方位放到离心机插孔中。把不用的离心套管取出，盖严离心机盖。 5．接通电源，开启开关，平稳、缓慢移动调速手柄，至所需转速。计时。 6．当达到离心所需时间后，将调速柄慢慢调回零位，关闭开关。待离心机自动停止转动后，再打开离心机盖取出样品。 7．用完后，取出套管中橡皮垫洗净，冲洗外套管，倒置干燥。 （六）实验室常见仪器设备简介：离心机、分光光度计、电泳仪、电子天平、pH计、水浴锅、电热干燥箱等。 实验二 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 一、原理 蛋白质的存在影响酸碱滴定中某些指示剂的颜色变化，即改变这些染料的光吸收。在此基础上发展了蛋白质染色测定方法。可用的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。 考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595 nm波长处比色测定。2~5即呈最大光吸收，至少稳定1小时。10~100 μg/ml蛋白质范围内均可。该法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性较差。高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂等对测定有干扰。缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。考马斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英杯测定。 二、试剂及器材 1．染色液：取考马斯亮蓝G-250 100 mg溶于50 ml 95%乙醇中，加入100 ml 85%磷酸，加双蒸水稀释至1 L。该染色液可保存数月，若不加水可长期保存，用前稀释。 2．标准蛋白溶液：结晶牛血清白蛋白bovine serum albumin, BSA）用蒸馏水配制成1 mg/ml浓度。 3．样品：经100倍稀释的牛奶。 三、操作 1．蛋白质标准曲线的绘制 管 号 试剂 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12（待测样品） 标准蛋白(μl) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 待测样品100 双蒸水(μl) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 染色液