吴海兰AFLP实验i.docVIP

名称 序列 EcoRⅠ接头 5-CTC GTA GAC TGC GTA CC-3 EcoRⅠ接头 5-CTG ACG CAT GGG TTA A-3 MseⅠ接头 5-GAC GAT GAG TCC TGA G-3 MseⅠ接头 5-TAC TCA GGA CTC AT-3 EcoRⅠ预扩增引物 5-GAC TGC GTA CCA ATT C-3 MseⅠ预扩增引物 5-GAT GAG TCC TGA GTA A-3 E-ACG 5-GAC TGC GTA CCA ATTC ACG-3 E-AAC 5-GAC TGC GTA CCA ATTC AAC-3 E-ACA 5-GAC TGC GTA CCA ATTC ACA-3 E-AGC 5-GAC TGC GTA CCA ATTC AGC-3 E-ACT 5-GAC TGC GTA CCA ATTC ACT-3 E-AAG 5-GAC TGC GTA CCA ATTC AAG-3 E-ACC 5-GAC TGC GTA CCA ATTC ACC-3 M-CAA 5-GAT GAG TCC TGA GTAA CAA-3 M-CAG 5- GAT GAG TCC TGA GTAA CAG-3 M-CTA 5- GAT GAG TCC TGA GTAA CTA-3 M-CAT 5- GAT GAG TCC TGA GTAA CAT-3 M-CTC 5- GAT GAG TCC TGA GTAA CTC-3 M-CTG 5- GAT GAG TCC TGA GTAA CTG-3 M-CTT 5- GAT GAG TCC TGA GTAA CTT-3 M-CAC 5-GAT GAG TCC TGA GTAA CAC-3 吴海兰 引物(Invitrogen)合成量5OD 各位战友，如果你是奋战在AFLP的战场上，我想说的是无论何时你一定得战胜平时科研中得难以名状得痛苦，甚至是老师和同学不以理解得寂寞。AFLP的确是种技术难度很高得分子标记，从酶切到银染，步步艰辛。往往分子标记大家都觉得以PCR为基础，不至于太难，其实做出来AFLP，尤其是做出好的结果真不是件容易的事儿。我曾经在研究生第一年没有任何结果，建立方法和平台都不知道从哪里下手，身边没有一个可以帮助我的人。我是强烈的推荐和感谢DXY，战友教会了我太多的东西，恨不得在毕业论文里致谢了。我把我摸索出来的实验体系公布出来，献给帮助我成长的DXY：1 DNA提取采用改进的CTAB法2 限制性消化与接头连接 2..1酶切反应体系为：DNA(100ng/μl) 2.5μlMseI(12U/μl) 0.25μlEcoRI (10u/μl) 0.25μlBuffer 4μlBSA 0.2μlddH2O 12.7μl2.2 酶切反应条件为：37酶切 3h72 10min2.3 连接体系为：酶切完成的DNA样品 5μlMA(25μmol/L) 1.0μlEA(5μmol/L) 0.5μlATP(10mmol/L) 0.25μlT4 DNA连接酶(3U/μl) 0.15μlBuffer 1.0μlddH2O 2.1μl2.4 连接反应条件为：16 连接过夜3 预扩增 3 1预扩增反应体系为：连接完成的DNA样品 1.0μlM00(50ng/μl) 0.6μlE00(50ng/μl) 0.6μl10×PCR Buffer 2.0μlTaq酶(5U/μl) 0.2μldNTP(10m mol/L) 0.4μlddH2O 15.2μl混合后加1滴石蜡油，进行预扩增。3.2 预扩增应条件为：Step 1: 72 5minStep 2: 95℃ 30sStep 3: 56℃ 30sStep 4: 72℃ 2minStep 5: Step 4 to Step 2 20个循环Step 5: 72 5minStep 6: 4℃ 保温扩增在PCR热循环仪上进行，预扩增。扩增产物在1.5%琼脂糖检测，-20保存备用。2.5 选择性扩增 2.5.1选择性扩增反应体系为：预扩增混合液 5.0μlMseI引物(50ng/μl) 0.8μlEcoRI引物(50ng/μl) 0.4μl10×PCR Buffer 2.0μlTaq酶(2u/μl) 0.4μldNTP(10mmol/L) 0.4μlddH2O 11.0μl混合后加1滴石蜡油，进行选择性扩增2.5.2选择性扩增反应条件为Step 1: 95 2min；Step 2: 95 30sStep 3: 65℃ 30s（每cycle降低0.7）Step 4: 72