DNS法测淀粉酶活性.docVIP

DNS法测淀粉酶活性 DNS溶液配方： 酒石酸钾钠：182g溶于500ml蒸馏水中，加热 在热溶液中依次加入：3,5-二硝基水杨酸：6.3g 氢氧化钠：20.69g 苯酚：5ml 亚硫酸钠：5g 搅拌溶解后，冷却定容1L，贮于棕色瓶中一周后使用。 葡萄糖标准曲线的测定 称取0.1g葡萄糖（干燥至恒质量），放入5mL的容量瓶中定容，配成浓度为20mg/mL的葡萄糖溶液。 再取2个5mL的容量瓶，分别吸取250μL的上述葡萄糖溶液加入到2个容量瓶中，定容，配成1mg/mL的母液。 取11个1mL的离心管，标号，分别吸取0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000μL上述母液加入到离心管中，然后补加水到1mL，制成浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mg/mL的葡萄糖标准液。 将上述各标准溶液转加到25mL的试管中，各加1mL的DNS溶液，90℃水浴5min，流水迅速冷却，加水定容至25mL。 在540nm下测定吸光值，绘制葡萄糖浓度与OD值的标准曲线。 二硝基水杨酸（DNSA）来测量可溶性淀粉中释放的还原糖。 反应混合液包括：50ul酶（菌株液体摇瓶，取菌悬液离心，取上清作为酶液）+450ulBuffer B（醋酸钠Buffer 20mM，pH5.5）+500ul 1%（w/v）可溶性淀粉（溶于Buffer B，需要现配现用，提前预热8min），最后加酶，60℃，5min。 加入几滴0.5M HCl，中断反应。 加入1.0mlDNS试剂，90℃，5min。 540nm测吸光值（空白：利用50ul蒸馏水代替50ul酶液，其他步骤相同）。 释放的还原糖量用葡萄糖标准曲线定量。 一个酶活单位：60℃每分钟释放1umol葡萄糖所需要的酶量。 醋酸钠Buffer 20mM，pH5.5（1L）：1.6406g NaAC固体，0.2ml冰醋酸，定容到1L。 0.5MHCl：一般盐酸的质量分数是36%，配成1M的溶液需要加入36%的盐酸86.2ml；若为10%的盐酸则需加入344.8ml盐酸。