HepG2细胞培养方法.docVIP

HepG2细胞培养方法 细胞复苏： 材料：HepG2细胞、RPMI-1640、胎牛血清、PS（青霉素+链霉素） 35cm细胞培养瓶、消毒的罗口离心管、消毒的吸管、水浴箱、计时器、离心机、光学显微镜 试剂配制： 100ml完全培养基：90mlRPMI-1640 + 10ml胎牛血清+1支PS，4℃保存 步骤： 罗口离心管加入含10%胎牛血清的完全培养基3ml.。 从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速置37℃水浴1min至融化。 打开冻存管，吸取细胞悬液至离心管，轻轻混匀。 800rpm离心5min,弃上清。 细胞沉淀中加入4ml完全培养基，转入35cm培养瓶37℃常规培养，第二天观察细胞生长情况。 细胞传代与换液： 材料：RPMI-1640、小牛血清、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS、PS、 35cm细胞培养瓶、消毒的罗口离心管、消毒的吸管、水浴箱、计时器、离心机、光学显微镜 试剂配制： 100ml终止液：90mlRPMI-1640 + 10ml小牛血清+1支PS，4℃保存 步骤： 对数增长期汇合度80%—90%的细胞可以传代，4ml PBS清洗两次。 加入0.25%胰酶1ml,37℃孵育5min。 加入3ml终止液，吹打细胞使其脱落并单个化，再移至罗口离心管。 离心5min,800rpm，弃上清。 罗口离心管加入完全培养基，混匀后分瓶培养。 细胞隔日可以用PBS清洗后更换培养基。 细胞冻存： 材料：RPMI-1640、小牛血清、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）、PBS、PS、35cm细胞培养瓶、消毒的罗口离心管、消毒的吸管、消毒的冻存管、水浴箱、计时器、离心机、过滤器、光学显微镜 试剂的配制： 10ml冻存液：7ml完全培养基+2ml胎牛血清+1ml DMSO,混匀后过滤，4℃保存 步骤： 去除培养瓶中旧的培养基，加入4ml PBS清洗两次。 混匀胰酶，每瓶加入1ml,37℃孵育5min。 每瓶加入3ml终止液，反复抽打细胞使其脱落并单个化，移至罗口离心管。 800rpm离心5min,弃上清。 每管加入1ml冻存液，混匀细胞，移至冻存管中。将细胞冻存管放于-20℃保存2hrs。 细胞冻存管-80℃过夜。 第二天转入液氮中保存。 细胞种板： 材料：RPMI-1640、小牛血清、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS、PS、 35cm细胞培养瓶、六孔板、消毒的罗口离心管、消毒的吸管、水浴箱、计时器、离心机、光学显微镜、细胞计数器 步骤： 将汇合度为80%-90%的HepG2细胞加入4ml PBS清洗两次。 加入1ml已混匀好的胰酶消化，37℃孵育5min。 培养瓶中加入终止液3ml，反复吹打使其脱落并单个化，细胞悬液转移至罗口。 800rpm离心5min,弃上清。 加入6.5ml完全培养基，充分混匀细胞，取15ul细胞悬液进行细胞计数，要求六孔板约5*106 -1*106 /孔。 将6ml细胞悬液转入六孔板，每孔1ml,轻轻摇匀悬液，使其均匀完全覆盖，37℃继续培养。 软脂酸和炎症因子处理HepG2细胞： 材料：RPMI-1640、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、甲醇、PBS、PS、 软脂酸 SIGMA P9767 、TNF-a、BSA 消毒的罗口离心管、消毒的吸管和EP管、过滤器、光学显微镜、测量计、过滤器 试剂配制： BSA培养液： 储存液：称取1g BSA溶于10ml RPMI-1640，混匀后过滤，4℃保存 工作液：一瓶RPMI-1640加入2mlBSA储存液和一支PS,即浓度为0.2%，4℃保存 软脂酸储存液：称取13.92mg软脂酸（分子量278.41）溶于1ml甲醇，即浓度为0.05mmol/ml，37℃水浴助溶，分为5份分装于EP管，-20℃保存 TNF-a储存液：称取10ngTNF-a溶解于1mlPBS,及浓度为10ng/ml，分为10份分装于EP管，-20℃保存 步骤： 低倍显微镜观察六孔板里细胞状态，保证无污染，无杂质，汇合度为70%-80%的细胞才可以进行下一步实验。 六孔板里的细胞加入1mlPBS清洗，每孔加入1ml 0.2% BSA的RPMI-1640，继续无血清培养24hrs。 不同浓度软脂酸处理细胞24hrs。（每组三个复孔） 对照组：用1mlPBS清洗后， 每孔1ml BSA继续培养。 0.02mmol/L palmitate: 1.2ul 软脂酸储存液+2998.8ul BSA,每孔1ml。 0.04mmol/L palmitate: 2.4ul 软脂酸储存液+2997.6ul BSA,每孔1ml。 0.08mmol/L palmitate: 4.8ul 软脂酸储存液+2995.2ul BSA,每孔1ml。 0.16mmol/L palmitate: 9.6ul 软脂酸储存液+2