SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质讲解.pptVIP

实验八 SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质 一、目的要求 1.学习电泳原理和技术 2.学习和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质技术 二、原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺 acrylamide，简称Acr 和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺 N，N—methylene-bisacylamide，简称Bis 在加速剂N，N，N?，N?—四甲基乙二胺 N，N，N?，N?—tetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED 和催化剂过硫酸铵 ammonium persulfate NH4 2S2O8，简称AP 或核黄素 ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4 的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳 polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE 。 聚丙烯酰胺凝胶有下列特性： 1 在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； 2 化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶； 3 对pH和温度变化较稳定； 4 几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好； 5 样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g 6 凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径； 7 分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。 凝胶浓度 T 的选择与被分离物质分子量密切相关。 表3.4 分子量范围与凝胶浓度的关系 分子量范围 适用的凝胶浓度/ % 蛋 白 质 ?104 20-30 1-4×104 15-20 1-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10 ?5×105 2-5 核酸 RNA ?104 15–20 104–105 5-10 105-2×106 2-2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。 目前常用的多为圆盘电泳 如图1 和板状电泳 如图2 ，两者电泳原理完全相同。 图1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图 A为正面,B为剖面  1 样品胶pH6.7 2 浓缩胶pH6.7  3 分离胶pH8.9 4 电极缓冲液pH8.3 图2 夹心垂直板电泳槽示意图 图3 凝胶模示意图1.样品槽模板 2.长玻璃板 1.导线接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框 4.样品槽模板 5.固定螺丝 6.上贮槽 7.冷凝系统 不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。 （1）样品浓缩效应 a 凝胶孔径不连续性： b 缓冲体系离子成分及pH值的不连续性； 在pH6.7的凝胶缓冲体系中 前导离子或快离子：HC1解离出的氯根 C1- 尾随离子 trailing ion 或慢离子：甘氨酸根 mcl?cl mp?p mG?G Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根 有效迁移率 m?，m为迁移率，?为解离度 当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质； （c 电位梯度的不连续性： 2 分子筛效应 3 电荷效应 图4 电泳过程示意图A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。 图5 不连续系统浓缩效应示意图  SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） ：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠 sodium dodecyl sulfate,简称SDS ，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDS测定蛋白质分子量。 三、试剂与器材 试剂：10%SDS、 凝胶贮液（30％ACr-0.8%Bis 、分离胶缓冲液（3.0 mol/L pH8.9Tris－HCl 缓冲液）、 浓缩胶缓冲液（ 0.5 mol/L pH6.7Tris－HCl 缓冲液）、10%过硫酸铵、 10%TEMED、 pH8.3Tris-Gly电极缓冲液、 1%琼脂糖溶液、0.05％考马斯亮兰R2