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果树种质资源超低温保存研究进展 摘 要：超低温保存是作物种质资源离体保存的有效方法之一。本文概述了超低温保存技术在果树种质资源保存中的应用及国内外研究进展，对存在的问题进行了分析，并对其发展提出了建议。 关键词：果树； 种质资源； 离体保存 中图分类号：S660.2文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）03-0122-05 植物种质超低温保存是指在低于-196℃ 的低温条件下对植物器官、组织或细胞进行保存。在这样的低温条件下，植物材料的代谢和生长活动几乎完全停止，因此，能够有效保持材料的遗传稳定性，同时又不会丧失其形态发生的潜能。所以，这是一种不需要继代的长期保存植物种质的有效方法[1，2]，也是果树品种改良和分子遗传学研究的前提和基础[3]。 随着现代果品业的发展，种质资源的重要性越来越被重视。1968年Quatran成功地保存了亚麻细胞，拉开了植物冰冻保存的帷幕。1973年Nag和Street超低温保存胡萝卜悬浮细胞获得成功，这是植物种质超低温保存的首次报道，之后超低温保存技术在植物种质保存方面的研究和应用逐渐深入。 将超低温保存技术与组织培养技术相结合，可以将大量的果树种质储存在液氮罐中[4]。这种保存形式的优点是果树的种质保存不受土地、人力等条件的限制且取材方便、效率高、极大地节省开支；此外，还可以避免种质保存过程中的自然变异，保证种质的遗传稳定性，同时有利于种质在国际间的交换[1]。 1 材料的选择 由于植物的基因型、抗冻性以及器官、组织和细胞的年龄、生理状态等因素对超低温保存效果有较大的影响[5]，从而要求在整个保存处理过程中采取相应的符合其材料特性的各种措施。不同基因型的植物材料对超低温保存的反应各不相同，冻后存活率的显著差异不仅存在于种间，也存在于不同品系间。赵艳华等（1998）[6]在包埋干燥超低温保存苹果离体茎尖时发现，材料的生理状态对茎尖存活率的影响甚至比保存过程中处理因素的影响更大。因此，在进行超低温保存前，对材料的选择十分重要。可以进行超低温保存的材料种类很多，主要分为4类：①茎尖和侧生分生组织[7]；②原生质体[8]；③悬浮培养物、愈伤组织和体细胞胚[9]；④其他植物器官，如胚、子房、花粉、花药、种子等[10]。 2 超低温保存种质资源的研究进展 2.1 超低温保存技术在苹果和梨中的研究进展 邵建柱（2003）[11]对苹果等果树种质资源的离体保存进行了研究，通过对试管苗状态的调整、外植体类型及大小的选择，结合密闭减少氧气供应和水分蒸发，成功地建立了适合苹果等果树离体材料的常温缓慢生长法保存技术。确定了15个梨品种离体茎段培养物的通用继代培养基，即MT+1.0 mg/L BA+0.1 mg/L NAA+2.0 mg/L GA3，为梨的离体保存研究初步奠定了基础。同时还完善了苹果和梨离体茎段的常低温保存技术，使得苹果和梨离体茎段在（3±0.5）℃条件下，保存28个月和24个月后，仍保持近100%存活率。进一步完善了苹果茎段的超低温保存技术，确立了甘油和ABA在预处理中的重要作用。 赵艳华等（2003）[12]以苹果离体茎尖为试材，对苹果离体茎尖超低温保存方法比较发现，包埋干燥法操作程序简单，存活率及再生率高，为最佳的保存方法。 2.2 超低温保存技术在枇杷中的研究进展 刘月学[13]采用干冻化法对枇杷花粉超低温保存进行了研究。结果表明：花粉的含水量是决定枇杷花粉超低温保存成败的关键因素，30%左右的含水量能够保证超低温保存后花粉的活力；解冻温度及方式对超低温保存后花粉的存活力没有明显影响。 刘小军（2002）[14]对经过干燥脱水至不同含水量的枇杷离体花粉进行了超低温（-196℃）保存试验。结果表明：超低温保存花粉时，花粉的含水量多寡是成败的关键。对于枇杷而言，选择含水量为13%左右的花粉比较合适。花粉在液氮中保存2、8 h和24 h，其发芽率无显著差异。 2.3 超低温保存技术在百合中的研究进展 张玉芹（2004）[15]对百合茎尖玻璃化超低温保存基本条件进行了研究，发现前处理和解冻方式是影响超低温保存存活率的主要因素。 陈辉（2005）[16]以百合试管苗茎尖分生组织为材料，对玻璃化法超低温保存技术进行了实验研究，并通过正交设计试验对影响超低温保存存活率的主要影响因素（预培养基中蔗糖浓度、预培养时间和PVS2处理时间） 进行了分析，初步建立了百合种质超低温保存的最佳技术方案。 2.4 超低温保存技术在樱桃中的研究进展 樱桃种质资源的离体保存研究起步较晚，目前尚未见大规模离体保存库建立的报道。Marthe对两个樱桃的中间砧进行过液氮超低温保存研究[17]。Niino采用PVS2玻璃化液对5个甜樱桃品种和2个樱桃砧木进行超低温保存，试验中所使用的玻璃化液中DMSO对材料具有毒害作用，高