海南普通野生稻OrERF1的克隆和表达分析.docVIP

海南普通野生稻OrERF1的克隆和表达分析 　　干旱、低温和高盐等非生物胁迫严重影响植物生长发育和作物产量。在长期的进化过程中植物已在分子、细胞和系统水平上进化出了一套复杂的调控机制来感受并响应各种外界刺激，转录因子调节下游基因的表达来应答环境变化是这一调控机制的重要环节。AP2/ERF（apetala2/ethy-lene response factor）家族转录因子含有60～70个氨基酸组成的高度保守AP2结合域，是植物中最大的转录因子之一，通过调节下游基因的表达广泛参与植物的生长发育、激素应答及对生物和非生物胁迫的响应。目前AP2/ERF转录因子已在拟南芥、水稻、玉米、大豆、西红柿、黄瓜等多种植物中得到鉴定。根据DNA结合元件的不同，可将AP2/ERF转录因子分为AP2、ERF、DREB（dehydration-responsive element-binding protein）和RAV（related to ABI3/VPl）4个亚家族，ERF家族是AP2/ERF转录因子大家族的一个主要亚家族，在调节植物对生物和非生物逆境反应中发挥重要作用。 　　普通野生稻（Oryza rufipogon， Griff）是亚洲栽培稻的祖先，能够长期生长在各种恶劣的自然条件下，具有很强的抗逆特性，是水稻抗逆育种重要的遗传资源。海南普通野生稻最原始，遗传多样性最高，具有很高的开发利用价值。在先前的研究中，筛选获得一批抗逆性较强的海南普通野生稻材料，能够长期在干旱、低温和贫瘠等条件下健康生长。为了进一步了解海南普通野生稻的抗旱机理，对干旱条件下差异表达基因进行了分析，并筛选获得了一个编码AP2/ERF转录因子的基因片段（结果未显示），本文在此基础上对该基因进行克隆和表达分析，为揭示该基因的功能奠定基础。 　　1材料和方法 　　1.1材料 　　将收集的普通野生稻（Oryza rufipogon Griff）种子置于50℃烘箱中干燥48h，打破休眠，用1%的HgCl2消毒10min，清水冲洗4～5次。置于人工气候箱培养，使用国际水稻所营养液进行培养，每5d换一次培养液，长至5叶期时于20%PFG条件下进行模拟干旱处理。150mmol/L NaCl条件下进行盐胁迫处理，4℃光照培养箱中进行低温处理，分别在处理0、2、4、6、12、24、48h取样，用液氮磨成干粉状，-70℃保存备用。 　　1.2OrERF1基因和启动子的克隆 　　根据先前筛选获得的AP2/ERF转录因子基因片段，在NCBI数据库中有哪些信誉好的足球投注网站到与它最相似基因的CDNA序列，设计特异引物OsERFIF：5一AGCGGTCCATGTGCTGTACCGGCGA-3和OsE-RF1R：5-TAGGGTTAATCACGATGTGATCCTG一3。根据OrERFl在水稻基因组中最相似基因的启动子序列设计特异性引物POsERFIF：5-AACGCACATATGTTCATTGCCTAA一3和POsE-RF1R：5-GCCACCTCGTCGCCGGTACAGCACA-T-3，分别以海南普通野生稻cDNA和基因组DNA为模板，对OrERF1的cDNA序列和启动子序列进行扩增。PCR扩增反应：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸5min。PCR产物经回收和纯化后，与pMD-18T Cloning Kit （TAKARA公司）连接。将连接产物转至DH5a感受态细胞，通过PCR检测确定阳性克隆，送北京诺赛基因组研究中心有限公司测序。 　　1.3生物学信息学分析 　　用ORF finder分析OrERFl cDNA序列的开放阅读框，蛋白质序列分析在http：//网站相关软件完成：通过BLAST （http：//）与GenBank中登记的序列进行同源性比较，用DNAMAN软件对氨基酸序列进行比对，并构建系统发育树；利用启动子顺式作用元件预测网站PLACE软件（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html）对OrERF1启动子序列进行分析。 　　1.4OrERF1的表达分析 　　采用北京康为世纪生物科技有限公司的SYBR green RT-PCR one step kit及Mx3005PPCR仪进行基因表达水平检测。目的基因引物为QOrERFIF：5-CTCAGTACGCGAGGTTCTTG-3和QOrERFIR：5-GAAGCTGTAGAGCACJTGTA-GTG-3；内参引物为18S，其引物为18S F：5一CGTCCCTGCCCTTTGTACAC-3和18S R：5-CG-AACACTTCACCGGATCATT-3。PCR程序为95℃预变性30s，95℃变性10s