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GSTpulldown操作流程
GST pull down操作流程mlLB＋单克隆＋Amp，37℃，250rmp培养过夜00ml LB＋Amp的1L锥形瓶中37℃，250rmp，2h，OD600≈0.6-0.8 3、取1ml菌液保存于Ep管中，sample1 4、大瓶加入400ul（1：1000）IPTG，4h 5、取1ml菌液保存于Ep管中，sample2 6、诱导后的收菌，6000rpm×8min 4度，去尽上清，PBS+1%Triton-100+PMSF（1：100 PMSF）（先加15ml，再加5ml）吹打混匀冰上超声破碎，开2秒，停9秒，总分钟。至裂解液14000rpm，分钟，4离心分离上清，取GST-Beads到管中，用，旋转1h 如果是小量纯化，就是50ul的GST-beads放EP管， 加细菌裂解液1ml 11、收集50ul的样品sample4，可与sample3作对照，检测beads的结合效率 12、用-20度预冷1％的Triton－x－100 in PBS洗3次，PBS洗3次 1000转 2min，弃上清，留beads等体积的液体（小量PBS是1ml洗，多次） 13、用大枪头剪去少许（beads：PBS 1:1）Lysis buffer 50mM NaH2PO4，PH8.0 300mM Nacl 10mMImidazole Wash buffer 1 50mM NaH2PO4，PH8.0 300mM Nacl 20mM Imidazole Wash buffer 2 50mM NaH2PO4，PH8.0 300mM Nacl 40mM Imidazole Elution buffer 50mM NaH2PO4，PH8.0 300mM Nacl 300mM Imidazole Elution buffer 40ml 50mM NaH2PO4 0.312g 300mM Nacl 0.701g 300mM Imidazole 0.8171g 三、pull down实验 1、his-pro加入到已纯化的EP管中，用PBS补足液体到600ul左右，以便蛋白之间能充分结合！4℃旋转结合PBS+0.1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。 loading buffer溶解beads上的蛋白，煮沸3分钟，高速离心Run SDS PAGE做Western Blot检测。
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