亲和原理篇.pptVIP

Title or job number 亲和层析 内容 亲和层析是通过生物分子的生物相互作用进行生物分子分离的一项液相分离技术。 亲和层析 亲和层析的主要步骤 亲和层析特点 容易纯化一些别的方法不能分离的蛋白 比如：从变性的蛋白中分离天然蛋白及其不同功能的亚型 经常一步可用大于95 %的纯度 从大量杂质中分离高纯度的目标物质 可以特异性的去除杂质 非常快速 配基: 特异性的和目标物结合的基团 基架: 可以和配基耦合的内部填料 耦合: 配基和基架之间的共价结合 结合: 配基和目标产物之间的结合 亲和填料 金属螯合：可反复螯合不同金属，再用已结合依赖不同金属的蛋 白，一种介质可做多种纯化工作 活化偶联：最常用的是NHS activated 4 Fast Flow 和CNBr activated 4 FF 小配体亲和：纯化抗凝血酶III，凝血因子脂酶等 抗体亲和： 颜料亲和：纯化白蛋白，干扰素等 外源凝集素亲和：刀豆球蛋白A - 多糖，糖蛋白等 核酸亲和 金属螯合 可用反复螯合不同金属，再结合依赖不同金属的蛋白。 （His组氨酸、Cys半光氨酸、Try色氨酸） 填料类型： IMAC Sepharose：固定化金属离子亲和层析填料，基架已经活化好了，可用于直接耦合金属离子。 Ni Sepharose：已经耦合了Ni离子，可以直接用于纯化His蛋白,载量极高，脱落极低。 Chelating Sepharose：亚氨双乙酸耦合的填料，可用结合不同的金属离子，脱落低。 耦合方法 1 (2) 耦合方法 2 (2) 小配体亲和填料 填料上预先已经耦合了不同类型的小配体，用以结合不同的特异性激酶、重组蛋白或者其他活性物质等。 填料类型： Glutathione Sepharose:填料上已经耦合了谷胱甘肽，可用结合含S-转移酶的重组蛋白。 Heparin Sehparose：纯化抗凝血酶III，凝血因子脂酶等。 Benzamidine Sepharose：专一性的结合丝氨酸蛋白酶、胰蛋白酶、类胰蛋白酶等。 其他填料：纯化不同的蛋白。 Benzamidine Sepharose? Binding capacity Maximum Comments operating flow Benzamidine Sepharose? 柱上GST 融合蛋白酶切及其 thrombin酶的去除 Binding capacity/ml Maximum Comments medium operating flow Binding capacity Maximum Comments operating flow Partial purification of recombinant DNA binding Oct-1 protein  Purification of coagulation factors Binding capacity/ml Maximum Comments medium operating flow 抗体亲和填料 抗体亲和填料主要是Protein A于Protein G。 填料类型： rProtein A Sepharose:基因工程重组的蛋白A,通过巯基偶联,具有方向性,载量较高。 nrProtein A Sehparose:无任何动物成分来源的基因工程重组蛋白A等,使用溴化氢偶联,脱落较少,无方向性,载量稍低。 rmpProtein A Sepharose: 蛋白A通过多位点螯合到基架上,极低脱落。 MabSelect 家族：可以耐受0.1-0.5M NaOH进行CIP，节省清洗成本，延长使用寿命。 颜料亲和填料 主要用于纯化白蛋白、干扰素、凝血因子等。 填料类型： Blue Sepharose:该类填料的配基模拟天然活性物质的结构，从而达到纯化目的，单是不是精确模拟。 Binding capacity Maximum Comments operating flow Purification of human serum albumin and interferon b 外源凝集素亲和填料 固相外源凝集素能和数种糖类残基发生可逆反应。适合纯化多糖和糖蛋白，以及凝集红血球和肿瘤细胞。 填料类型： ConA Sepharose:纯化多糖和糖蛋白 Lentil Lectin Sepharose：凝集红血球和肿瘤细胞 Binding capacity/ml Maximum Comments medium operating flow Purification of a cell surface an