实验设计书详解.ppt

Company LOGO Company LOGO 丹参酮ⅡA对骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的影响 Contents 实 验 设计书 1 2 3 4 5 研究现状 理论依据 研究内容 动物实验 研究方法 心肌梗死：在冠状动脉病变的基础上，发生冠状动脉血供急剧减少或中断，使相应的心肌出现严重而持久地急性缺血性坏死。一旦发生将造成心肌细胞不可逆损伤、坏死，然而成熟的心肌细胞不能再生，且梗死区的心肌最终被纤维组织所取代，心功能受到严重影响。 研究现状 静脉溶栓 抗凝 抗心肌缺 血 调脂 心脏血运 的重建 骨髓间充质干细胞 移植 Mesenchymalstem cells（MSCs） 什么是骨髓间充质干细胞(MSCs)？ 属于成体干细胞的一种，是中胚层发育的早期细胞，是骨髓中除了造血干细胞之外的另一类干细胞，其具有干细胞的共性，即自我更新及多向分化能力。 目前已有多项基础和临床研究发现MSCs移植既能促进血管新生，又能促进心肌细胞的再生，从而明显改善心肌梗死后的心功能，缩小梗死面积。 MSCs移植 冠脉移植 静脉移植 心外膜移植 心内膜移植 理论依据 MSCs移植主要有以下途径 理论依据 研究发现：间质细胞因子-1(SDF-1)及其特异性受体CXCR4组成的SDF-1-CXCR4轴在干细胞的募集过程中起到了关键作用 MSCs 理论依据 用转基因等方法提高心脏的SDF-1表达能够促进干细胞向受损心脏的募集，激活细胞生存信号通路，增加心肌梗死部位的血管新生，最终促进心梗后心功能的恢复。因此，上调SDF-1／CXCR4通路不失为一个增加干细胞在受损组织内植入、促进心功能恢复的好方法。 研究发现，丹参酮IIA(TanIIA)具有通过调控SDFl／CXCR4轴以促进MSCs向心梗部位的募集的作用。 丹参酮IIA促进MSCs向心梗部位的募集作用 丹参酮IIA 冠脉移植 静脉移植 心外膜移植 研究方法 介入法栓塞冠状动脉左前降支的第二对角支远端建立猪心肌梗死模型，建模成功后将猪随机分为9组，每组5头。4周后进行自体MSCs移植，三个移植组分别经耳缘静脉、冠状动脉、心外膜注射用BrdU标记的MSCs悬液5ml(1×107)，每组各设细胞移植+丹参酮IIA及对照组，用同样方法注射骨髓MSCs+丹参酮IIA及DMEM培养液5ml。移植4周后行心脏超声及心脏磁共振检查，评价治疗心肌梗死的效果，组织学检查梗死区心肌形态改变及移植细胞在心肌内的分布情况。 动物实验 同一品种的健康猪 性别：雌雄各半 年龄：3月龄 数量：45只 体重：20--25kg 实验对象 主要试剂 1.丹参酮IIA 2.盐酸利多卡因注射液 3.肝素钠注射液 4.Ficoll淋巴细胞分离液 5.胎牛血清(FCS) 6.DMEM培养液 7.台盼蓝 8.0.25％胰酶+0．02％EDTA 9.硫酸阿托品注射液 10.盐酸氯胺酮注射液 11.安定(地西泮)注射液 12.泛影葡胺 13.明胶海绵 14.青霉素 15.BrdU标记液 16.BrdU抗体 一抗为小鼠抗猪单抗(1：50稀释) 二抗为两步法羊抗小鼠IgG+FITC 主要设备 1.台式低温高速离心机 2.CA950．2超净工作台 3.Eclips TS 100倒置相差显微镜 4.BB5060型C02恒温培养箱 5.数字减影血管造影机 6.PD．1200型心电监护仪(带除颤设备) 7.胸外科手术器械 8.心导管 9.5500型心脏超声诊断仪 10. 1.5T磁共振成像仪 11.冰箱 仪器与药品 动物实验 l、猪骨髓MSCs的分离和培养 1.1 分离 1.2 培养 2、猪心肌梗死模型的建立 3、动物分组 对照组3组： A、静脉对照组 B、冠脉对照组 C、心外膜对照组： 细胞移植组6组： D、静脉移植组 G、静脉移植+丹参酮IIA组 E、冠脉移植组 H、冠脉移植组+丹参酮IIA组 F、心外膜移植组 I、心外膜移植组+丹参酮IIA组 实验步骤 动物实验 4、MSCs的移植 4.1 静脉移植组 4.2 冠脉移植组 4.3 心外膜移植组 4.4 对照组 4.5 静脉、心外膜、冠脉移植+丹参酮IIA组 5、心脏超声检查 6、心脏磁共振检查 7、组织学检查 7.1 HE染色 7.2免疫组织化学鉴定 实验步骤 动物实验