第四章微生物细胞破碎.pptVIP

微生物代谢产物分泌到细胞外，称为胞外产物；目的产物存在于细胞内部，称为胞内产物。 第一节 细胞壁的组成与结构 一、细菌细胞壁 主要化学成分：肽聚糖； 主要阻力：肽聚糖的网状结构。 二、酵母细胞壁 主要化学成分：葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质和脂类； 主要阻力：壁结构交联的紧密程度和它的厚度。 三、霉菌细胞壁 化学成分：几丁质和葡聚糖； 主要阻力：几丁质或纤维素的纤维状结构。 四、细胞壁结构与细胞破碎 在机械破碎中，细胞个体小、球形、壁厚、聚合物交联程度高是最难破碎的。 第二节 常用破碎方法 一、珠磨法(bead mill) 珠磨法破碎动力学方程 ln[1/(1-R)]=Kt R——破碎率（%） K——破碎速率常数（1/s） t——间歇操作时的破碎时间，连续操作时为细胞 悬浮液在破碎室内的平均停留时间（s） 与K有关的操作参数 珠体直径 实验室规模研磨机0.2mm，工业规模不得小于0.4mm； 珠体的装量 宜控制在80%珠体体积/腔体自由体积； 细胞浓度 最佳的细胞浓度应该用实验来确定； 料液性质 搅拌器转速与构型 操作温度 珠磨法 总的来说：延长t，增加珠体装量，提高搅拌转速和操作温度等都可有效提高R。 珠磨法的破碎率一般控制在80%以下。因为高的R，能耗大；产热多，冷却难度大；产物失活损失增加；细胞碎片小，不易分离。 二、高压匀浆法 高压匀浆法破碎动力学方程 ln[1/(1-R)]=Ktnpa R ——破碎率 Kt——与温度等有关的破碎常数 n ——循环操作次数 p ——操作压力 a ——与微生物种类有关的常数 影响高压匀浆法破碎的因素 压力 工业生产中，通常压力为55～70MPa 温度 高温只适用于非热变性产物 菌体种类 菌体生长环境 高压匀浆法 是大规模细胞破碎的常用方法 适用于酵母和大多数细菌细胞 不适用于团状或丝状真菌、较小的革兰氏阳性菌及有包含体的基因工程菌 高压匀浆法与珠磨法比较 三、超声破碎法(Ultrasonication) 一般认为的机理是：在超声波作用下，液体发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。 超声波法的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能及处理时间有关。 超声破碎法的特点 适应于实验室规模的应用 易失活物质不宜用 G-菌破碎效果好，酵母效果差 ?四、酶溶法 利用酶反应，分解破坏细胞壁上的特殊键，从而达到破壁的目的。 有两种酶溶法：外加酶法、自溶法。 1、外加酶法 革兰氏阳性菌——溶菌酶 革兰氏阴性菌——溶菌酶、EDTA螯合剂 放线菌——溶菌酶 酵母、霉菌——蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶 植物细胞——纤维素酶、半纤维素酶 外加酶法的特点 优点： 条件温和，核酸泄出量少，选择性释放产物，细胞外形完整。 缺点： 酶价格高，通用性差，产物抑制的存在。 2、自溶法 利用微生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。 可控制一定的条件使微生物产生过剩的溶胞酶或激发该酶的活性。 缺点：易引起所需蛋白质变性；自溶后，细胞悬浮液粘度上升，过滤速率下降。 五、化学渗透法 使用某些可以改变细胞壁或膜的通透性的化学试剂，使胞内物质有选择地渗透出来，称为化学渗透法。? 化学渗透法的试剂及其原理 表面活性物质：促使细胞壁或膜某些组分溶解 常用的表面活性剂：十二烷基磺酸钠、Triton X-100和吐温(Tween)等 EDTA螯合剂：与细胞壁或膜结构中Ca2+或Mg2+螯合 化学渗透法的试剂及其原理 有机溶剂：能分解细胞壁及膜中的类脂 常用的有机溶剂：甲苯、二甲苯、氯仿和高级醇等 变性剂：与水中氢键作用，减弱水的极性，使疏水性化合物溶于水。 常用的变性剂有：盐酸胍和脲 化学渗透法的特点 优点： 选择性释放产物；细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。 缺点： 通用性差；时间长、效率低；有些化学试剂有毒。 六、其他方法 X-press法 渗透压法 反复冻结-融化法 干燥法 1、X-press法 X-press法是将浓缩悬浮液冷却至-25℃形成冰晶体，再利用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。 主要用于实验室，具有适应范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点，但它不适用于对冷冻敏感的生化物质。 2、渗透压法 将细胞置于高渗透压的介质中，达到平衡后，把介质突然稀释或将细胞转置于低渗透压的水或缓冲溶液中，在渗透压的作用下，水通过细胞壁和膜渗透进细胞内，由于原生质的膨胀而使细胞破裂。 适用于易破碎的细胞 高渗透压介质：一定浓度的甘油或蔗糖溶液。 3、反复冻结-融化法 将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。 原理：