PCR简单介绍.pptx

PCR-生物学的聚合酶链反应简单介绍和应用酒乌鞘蛇【鉴别】聚合酶链式反应法。模板DNA提取 取本品0.5g，置乳钵中，加液氮适量，充分研磨使成粉末，取0.1g置1.5ml离心管中，加入消化液275μl[细胞核裂解液200μl，0.5mol／L乙二胺四醋酸二钠溶液50μl，蛋白酶K(20μg／ml)20μl，RNA酶溶液5μl，在55℃水浴保温1小时，加入裂解缓冲液250μl，混匀，加到DNA纯化柱中，离心(转速为每分钟10000转)3分钟；弃去过滤液，加入洗脱液8 0μl[5mol／L醋酸钾溶液26μl，1mol／L Tris-盐酸溶液(pH值7.5)18μl，0.5mol／L乙二胺四醋酸二钠溶液(pH值8.0)3μl，无水乙醇480μl，灭菌双蒸水273μl，离心(转速为每分钟10000转)1分钟；弃去过滤液，用上述洗脱液反复洗脱3次，每次离心(转速为每分钟10000转)1分钟；弃去过滤液，再离心2分钟，将DNA纯化柱转移入另一离心管中，加入无菌双蒸水100μl，室温放置2分钟后，离心(转速为每分钟10000转)2分钟，取上清液，作为供试品溶液，置零下20℃保存备用。另取乌梢蛇对照药材0.5g，同法制成对照药材模板DNA溶液。PCR反应? 鉴别引物：5′GCGAAAGCTCGACCTAGCGAAGGGGACCACA3′和5′CAGGCTCCTCTAGGTTGTTATGGGGTACCG3′。PCR反应体系：在200μl离心管中进行，反应总体积为25μl，反应体系包括10×PCR缓冲液2.5μl，dNTP(2.5mmol／L)2μl，鉴别引物(10μmol／L)各0.5μl，高保真Taq DNA聚合酶(5U／μl)0.2μl，模板0.5μl，无菌双蒸水18.8μl。将离心管置PCR仪，PCR反应参数：95℃预变性5分钟，循环反应30次(95℃30秒，63℃ 45秒)，延伸(72℃)5分钟。电泳检测 照琼脂糖凝胶电泳法(三部附录Ⅵ B)，胶浓度为1％，胶中加入核酸凝胶染色剂GelRed；供试品与对照药材PCR反应溶液的上样量分别为8μl，DNA分子量标记上样量为2μl(0.5μg／μl)。电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上或紫外透射仪上检视。供试品凝胶电泳图谱中，在与对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上，在300～400bp应有单一DNA条带。PCR的定义及应用聚合酶链反应（英文全称：Polymerase Chain Reaction），简称PCR。聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何DNA,RNA的地方．聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。PCR技术原理是根据已知DNA片段序列，人工合成与该DNA两条链末端互补的寡核苷酸引物，在酶促作用下将待检DNA序列进行体外扩增。PCR的原理PCR反应体系基本成分模板DNA-模板DNA提取-试剂盒引物 dNTPs(4中脱氧核苷酸)DNA聚合酶适宜的缓冲液试剂盒的介绍 试剂盒是用于盛放检测化学成分、药物残留、病毒种类等化学试剂的盒子。配有进行分析或测定所必需的全部试剂的成套用品。如医学上特定疾病诊断试剂盒、分子生物学上的核酸提取回收试剂盒、微生物学上的细菌鉴定试剂盒等。试剂盒的产生试剂盒的产生正是为了使实验人员能够摆脱繁重的试剂配制及优化过程，所以试剂盒中一般配备有相应的使用说明书，用户按照说明书不需或只需少量的优化即可得到满意的结果。　⑴试剂盒使用说明书　说明书一般包括公司标志及名称、试剂盒名称、试剂盒组成、保质期、使用领域、使用方法等项目。　①一般在页眉页脚处为公司的名称及标志；　②接下来为试剂盒的名称；　③试剂盒组成中应为试剂盒中的所有内容，为了简介明了，一般以表格的形式表现；　④操作步骤是试剂盒说明书中最重要的部分，内容应准确、简洁、易懂，不能包含带有歧义的句子，更不能含糊其辞，排版上操作步骤应将复杂的步骤拆解，使人一目了然。可以说操作步骤为试剂盒的灵魂。PCR反应的特异性决定因素　①/wiki/%E5%BC%95%E7%89%A9引物与模板DNA特异正确的结合；②/wiki/%E7%A2%B1%E5%9F%BA碱基配对原则；③Taq?DNA聚合酶合成反应的忠实性；④/wiki/%E9%9D%B6%E5%9F%BA%E5%9B%A0靶基因的特异性与保守性。　其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶