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分子生物学常用技术 核酸的分子杂交 Nucleic acid hybridization 分子杂交的形式： 液相杂交 固相杂交 它们之间的区别和优劣 固相杂交的一般过程 1.首先设计、合成探针。 2.收集标本，并提取核酸。 3.将提好的核酸样本点到固相支持物上。 4.封闭。 5.通过变性和复性完成杂交。 6.漂洗 7.放射自显影 核酸分子杂交技术的演变 斑点杂交 southern blot northern blot 原位杂交 芯片技术 斑点杂交 southern blot southern blot 原位杂交 染色体原位杂交 组织切片上的原位杂交 芯片技术 芯片技术的基本原理： 可以将所有已知的某一类核酸信息制备成探针，通过现代化的技术将其集中安放在一块特殊材料上（如硅片或其它材料上）。 用芯片来与标本DNA进行杂交。 将杂交结果通过计算机软件进行分析，得出结论。 GeneChip? Array Construction 芯片技术的基本条件： 所有探针的信息（核酸序列）必须是已知的。 已知信息（生物信息）的数量要足够多。 制备芯片需专用的设备。但有商品可供选择。 要具有高分辨能力的扫描设备。 杂交后的信息要通过计算机进行分析和处理。 芯片技术的优点： 通量大，所得的信息数量大。 效率高，省时间。 目前应用的问题 成本。 真正有用的生物信息还不尽人意。 芯片技术的优点： 通量大，所得的信息数量大。 效率高，省时间。 目前应用的问题 成本。 真正有用的生物信息还不尽人意。 芯片技术的应用： 聚合酶链式反应 Polymerase chain reaction (PCR) PCR技术的形成及发展 PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适的条件——模板DNA ，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间, 合成DNA的原料。 PCR的改进与完善 Mullis最初使用的 DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温， 90℃会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视 1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度 (2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现为PCR技术的广泛应用打下了基础。 PCR 技术的实验原理 模拟细胞内DNA合成的过程 利用了DNA变性、复性和能进行杂交的特点，在引物存在的条件下DNA聚合酶开始对DNA进行体外合成。 通过全自动的热循环仪来完成 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 P