今日上课流程.docx

植物啟動子-GUS分析plantpromoter-GUSanalysis104/10/07授課教授：傅士峯老師助教：呂學宇、張凱雅值日組：G4植物生理學實驗5今日上課流程開始上課無菌操作-種植基因轉殖圓葉煙草（值日組前1週預做）Gus染色交代作業2(pNbCMT3-2::GUS)實驗目的進行植物基因轉殖，需檢測目標基因是否正確進入植物細胞和正常表達故本次實驗使用promoter-GUS做為基因表達的分子標誌(MolecularMarker)，經X-Gluc呈色反應後，便可於具有基因活性之組織呈現藍色，藉此觀察轉基因的組織特異性3實驗原理4目標基因的promoter什麼是Gus?β-葡萄糖苷酸酶（β-glucuronidase,Gus）存在於大多細菌的質體催化β-葡萄糖苷酯類物質水解3’端與其它基因結合也能正常表達，且Gus仍具酵素活性gus基因廣泛用於目標基因植物和真菌的檢測5GUS檢測方法組織化學染色定位法使用X-Gluc為受質，進入植物組織和細胞質若該細胞的轉殖基因具有活性，表現出Gus蛋白，便可將X-Gluc水解成藍色物質藉由呈色反應直接觀察組織染色，以推測轉殖基因的組織特異性6X-GlucGus5,5-二溴-4,4-二氯靛藍染料實驗步驟加入2mlFixativesolution於閃爍計數瓶將sample放入Fixativesolution中等待30分鐘（放冰上）（shaker）（此時配x-gluc溶液）72mlfixativesolution實驗步驟進行30分鐘的wash，每10分鐘一次，共三次清洗時將Fixationsolution倒掉，再加入2ml新的0.1MsodiumphosphatebufferWash3次以後，再加入2mlx-glucsubstratesolution82ml0.1Msodiumphosphatebuffer每次10min，清洗3次2mlx-glucsubstratesolution實驗步驟真空處理：抽氣10分鐘，進行2次抽氣結束，先關pump再緩慢關氣閥，才拿起大罩子9實驗步驟將sample用鋁箔紙包起來overnight(10hrs)，避光37℃將x-glucsubstratesolution吸掉，加入2mlEtOH70%，脫染shake2~3次（每次1hr）直到sample完全脫色10X-glucsubstratesolution配方25mgx-gluc粉末（難溶,先用甲醇溶解）2.5mlmethanol0.25ml10%Triton(界面活性劑)0.5ml0.5Mpotassiumferrocyanide亞鐵氰化鉀0.5ml0.5Mpotassiumferricyanide鐵氰化鉀21.25mlwater25ml0.2MSodiumphosphatebuffer11(氧化劑)無菌操作台使用全程在無菌操作台物品進入操作台前都須先噴酒精12組織培養拿需要種子數無菌操作13種子消毒連續搖晃5%NaClO3min無菌水1min無菌水1min無菌水1min消毒水，內含界面活性劑組織培養使用乳頭滴管，使用前先過火再開始種植須取種子，每排10顆，放置培養基上14種植問題討論今天使用到的gus是一種報導基因，請舉出來還可以利用哪些基因當做報導基因？15報告繳交報告格式： 1.實驗目的 2.實驗原理 3.實驗結果 4.問題與討論5.補充資料6.心得繳交期限：下周三(10/17)課程結束前G5、G6留下安排值日時間16