参考资料--蛋白含量测定的方法.docVIP

蛋白含量测定的方法： 1. 凯氏定氮法?? 经典的标准方法，但现在已不多用。 2. 双缩脲法?????? 与硫酸铜－氢氧化钠溶液发生颜色反应。 3. Lowry法（Folin－酚试剂法）?? 多年来的蛋白标准测定方法，近年来得到改进，即下面的BCA法。 4. BCA法????? 4，4’－二羧－2，2’－二喹啉（bicinchoninic，BCA）与Cu+反应生成紫色复合物。 5. 紫外吸收法????? 280nm波长? 精确度不高，但操作简便，样品可回收。 6. Bradford法（考马斯亮蓝结合法?）??? 灵敏度高，能检测一个微克的蛋白，重复性好。 7. 胶体金测定法灵敏度最高，可达纳克水平。胶体金是一种带负电的疏水胶体，洋红色，遇蛋白变蓝。 8. 特殊蛋白特殊方法 ? 蛋白纯度鉴定的方法： 通常采用物理化学的方法 a. 电泳??????包括?等电聚集、 聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS－PAGE、 毛细管电泳 b. 沉降????? 纯蛋白在离心场中以单一的速度移动。 c. HPLC??? 常用于多肽、蛋白纯度鉴定。纯的样品在HPLC的洗脱谱上呈现出单一的对称峰。 d. 溶解度分析? 恒浓度法（原理：纯蛋白在一定溶剂系统中具有恒定的溶解度，而不依赖于存在于溶液中未溶解固体的数量，在严格条件下，以加入的固体蛋白对溶解的蛋白做图，将只呈现一个折点，折点以前斜率为1，折点之后斜率为0，不纯的蛋白往往呈现2个或更多的折点。） e. N端分析?? 纯的蛋白N端残基只能是一种氨基酸。 ? 需要指出：采用任何单独一种方法鉴定所得结果只能作为蛋白均一性的必要条件而不是充分条件。事实上只有很少几个蛋白能够全部满足上面的严格要求，往往是在一种鉴定中表现为均一的蛋白，在另一种鉴定中又表现出不均一性。 本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。了解各种测定方法的基本原理和优缺点。 ??? 蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin －酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford 法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 ??? 值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。 一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。? ? 方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明 凯氏定氮法 （Kjedahl法） 灵敏度低，适用于0.2~ 1.0mg氮，误差为 ?2％ 费时?? 8～10小时 将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离） 用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长 双缩脲法（Biuret法） 灵敏度低 1～20mg 中速??? 20~30分钟 多肽键＋碱性Cu2＋?紫色络合物 硫酸铵； Tris缓冲液； 某些氨基酸 用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似 紫外吸收法 较为灵敏 50～100?g 快速??? 5～10分钟 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收 各种嘌吟和嘧啶； 各种核苷酸 用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正 Folin－酚试剂法（Lowry法） 灵敏度高 ～5?g 慢速? 40～60 分钟? 双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原 硫酸铵； Tris缓冲液； 甘氨酸； 各种硫醇 耗费时间长；操作要严格计时； 颜色深浅随不同蛋白质变化 考马斯亮蓝法(Bradford法) 灵敏度最高 1～5?g 快速 5～15分钟 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其?max由465n