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动物血中超氧化物歧化酶的提取与纯化 一、超氧化物歧化酶的提取 [原理] l969年，McCord和Fridovich第一次从牛血中提纯到超氧化物岐化酶。自然界中SOD分布极广，其含量随生物体的不同而不同，即使同一种生物的不同组织或同一组织的不同部位，其SOD的种类和含量也有很大差别。迄今为止人们已从细菌，真菌、原生动物。藻类、昆虫、鱼类、植物和动物等各种生物体内分离得到SOD。为拓宽提取SOD的原料，筛选或基因过程开发产SOD量较高的菌株。目前，研究开发最多的资源还是从动物血液、动物组织中制备提纯SOD。 从动物血液材料中制备Cu Zn-SOD纯化工艺分为三个主要步骤： （1）原材料的预处理； （2）粗酶液的制备； （3）离子交换柱层析精制。 国内多采用Mccord和Fridovich法，其主要工艺过程为： 第一步，乙醇-氯仿除去血红蛋白； 第二步，有机溶剂和硫酸铵分级沉淀； 第三步，离子交换柱层析精制。 [试剂和器材] 1、试剂 3.8%（质量分数）柠檬酸三钠；0.9%（质量分数）氯化钠 ；95%（体积分数）乙醇；氯仿；丙酮 ；pH7.6、2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液 ；DEAE-Sephadex A-50 2、器材 猪血；恒温水浴 ；离心机 ；布氏漏斗；抽滤瓶；烧杯、量筒、搅棒等；透析袋 [方法和步骤] 1、从猪血中提取SOD （1）分离血球 取新鲜猪血，加入到3.8%柠檬酸三钠抗凝液中，新鲜猪血与抗凝液的比例为3：1，轻轻搅拌均匀，4 000r/min离心20min，收集红血球。 （2）除血红蛋白 红血球用3倍体积生理盐水洗涤，4 000r/min离心20min，重复三次，然后向洗净的红血球加入1～1.1倍体积去离子水，搅拌溶血30min，再向溶血液中分别缓慢加入0.25倍体积的预冷95%乙醇和0.15倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌15min左右，静置1h，然后4 000r/min离心20min除去变性血红蛋白沉淀，取清液，过滤，收集滤液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。 （3）热变性 上清液加热到65℃，保温10min，然后迅速冷却到室温，3 000r/min离心20min，弃去沉淀物，收集上清液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。 （4）沉淀 清液在盐冰浴中冷却，然后在-5℃以下的操作温度下，加入1.5倍量预冷丙酮，边加边搅拌均匀，即有白色沉淀产生，静置2～3min，迅速抽滤，弃去滤液得肉色沉淀。沉淀物用少量蒸馏水溶解，4 000r/min离心20min，除去不溶物，用pH7.6的2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液透析，即得粗SOD溶液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。 二、离子交换层析纯化超氧化物歧化酶 [原理] 本实验利用超氧化物歧化酶的解离性质，在一定缓冲液条件下与离子交换纤维素吸附和解吸的能力不同于溶液中杂蛋白，进而除去杂蛋白。实验中选用DE-32离子交换纤维素。 相关原理请参见实验教材中离子交换层析一章。 [试剂和器材] 1、试剂 DE-32 ；缓冲液Ⅰ：2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4（pH7.6） ；缓冲液Ⅱ：200mmol/L K2HPO4-KH2PO4（pH7.6） 2、器材 层析柱(2.5cm × 25cm)；部分收集器 ；梯度洗脱仪；紫外分光光度计；试管、透析袋 [方法和步骤] 1、DEAE-纤维素的预处理： （1）称取5gDE-32，撒在盛有75mL 0.5mol/L HCl的烧杯中，室温放置30min，不时轻轻搅拌。 （2）将糊状物移入3号砂芯漏斗中，用蒸馏水淋洗。如此重复，每加一次去离子水，浸泡一段时间，再进行抽滤，至洗涤液pH等于4即可（pH试纸试）。 （3）将糊状物移入烧杯中，加入75mL 0.5mol/L NaOH，放置30min，不时轻轻搅拌，弃去上清液，依同法用0.5mol/L NaOH再处理一次。 （4）将交换剂移入3号砂芯漏斗中，反复用去离子水淋洗，直至洗涤液pH为8.0（可用pH试纸测试）。 （5）将DEAE-纤维素浸泡在150mL去离子水中。用0.5mol/L 盐酸把pH调至7.6，滴定可在pH计上进行，须使悬液最终pH在10min内无变化，然后抽滤。 （6）将上述滤块置于100毫升量筒中，加入75mL缓冲液I，慢慢搅混之