第四章酶蛋白的化学修饰研究.pptVIP

Enzyme Engineering酶工程;第三章 酶蛋白的化学修饰;第一节 化学修饰的原理;三、酶化学修饰的基本原理 1． 如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 2． 如何保护酶活性部位与抗抑制剂 3． 如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 4． 如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境 影响酶化学修饰反应进程的因素主要有两个： 酶蛋白功能基的反应性 修饰剂的反应性;影响酶化学修饰反应进程的因素： 酶蛋白功能基的反应性 微区的极性：是决定基团解离状态的关键因素之一。 氢键效应：蛋白质或其离子通过氢键来维持稳定性。 静电效应：带电基团之间的相互影响造成的。 位阻效应：当烷基在空间上紧靠着蛋白的功能基，会使修饰剂不能与功能基接触，这时会出现位阻效应。 酶蛋白功能基的超反应性：蛋白质的某个侧链基团与 个别试剂能发生非常迅速的反应。但不一定是酶的活 性部位基团。 ;影响酶化学修饰反应进程的因素： 修饰剂的反应性 选择吸附 ：修饰剂根据各自特点，选择性地吸附在低极性区域或高极性区，形成蛋白质－修饰剂复合物。 静电相互作用：带电修饰剂可以选择性地吸引在蛋白质表面带相反电荷的部位。(碘乙酸和碘乙酰胺烷基化的速度) 位阻因素：位阻因素都可能阻止修饰剂与功能基的正常反应。(α－溴代酸的大小影响修饰） 催化因素：不同的修饰剂，其反应速度和反应部位有明显差异，较大程度上与酶的酸碱催化有关。 局部环境的极性：大多反应会与溶剂的极性有关，且溶剂效应相当复杂。 ;第二节 化学修饰的方法学 ;一、 修饰剂的要求;二、 反应条件的选择;三、 酶性质的了解; 修饰酶的性质及特点;热稳定性;体内半衰期;酶学性质的改变; 对组织的分布能力变化;;;;四、 酶修饰方法;第三节 酶蛋白侧链的修饰 ;一、几种重要的修饰反应;2．烷基化反应 ;3．氧化和还原反应 ;4．芳香环取代反应 ;二、特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰 ;;2．氨基的化学修饰 氨基容易被选择性修饰，氨基烷基化已成为重要的赖氨酸修饰方法，化学修饰也常用于蛋白质序列分析（多肽链的N端分析）。 常用修饰剂：卤代乙酸、芳香卤、磷酸 吡哆醛、2，4－二硝基氟 苯DNFB、丹磺酰氯DNS ;;3．羧基的化学修饰 ;4．咪唑基的化学修饰 组氨酸残基位于许多酶的活性中心，修饰剂焦碳酸二乙酯DPC对其有较好的专一性，修饰产物在240nm处有最大吸收。 常用修饰剂：碘代乙酸、焦碳酸二乙酯DPC（均能修饰咪唑环上的两个氮原子） ;;5．胍基的化学修饰 精氨酸残基的胍基在中性或弱碱性条件下能与修饰剂发生反应。 常用修饰剂：具有两个临位羰基的化合物——丁二酮、苯乙二醛、1，2－环己二酮等。 ;;6. 酚羟基的化学修饰 酪氨酸残基的酚羟基可被修饰。苏氨酸和丝氨酸残基的羟基也可被该类修饰剂修饰，且产物更为稳定，但反应条件严格。 四硝基甲烷TNM在温和条件下高度专一性地硝化，生成可电离的发色物质，可用于氨基酸定量分析。 常用修饰剂：四硝基甲烷TNM、碘、二异丙基氟磷酸酯DFP ;;7. 色氨酸吲哚基的化学修饰 色氨酸残基的吲哚基比巯基、氨基反应性差，HNBB 和4－硝基苯硫氯对吲哚基修饰比较专一。Koshland试剂Ⅱ[二甲基－（2－羟基－5－硝基苄基）溴化锍],水溶性好，有利于修饰酶，修饰色氨酸时应对巯基进行保护。 常用修饰剂：N－溴代琥珀酰亚胺NBS、2－羟基－5－硝基苄溴HNBB、4－硝基苯硫氯、Koshland试剂Ⅱ ;;三、研究热点-核酸类酶的修饰 ;第四节 酶的亲和修饰;一、亲和标记 用于亲和标记的亲和试剂应符合如下条件： 在使酶不可逆失活之前，亲和试剂要与酶形 成可逆复合物； 亲和试剂的修饰程度是有限的； 没有反应性的竞争性配体的存在应减弱亲和 试剂的反应速度； 亲和试剂体积不能太大，否则会产生空间障碍； 修饰产物应当稳定，便于表征和定量。;亲和标记分类 Ks型不可逆抑制：底物、竞争性抑制剂 对修饰有保护作用，反应定量定点进行。 Kcat型不可逆抑制：专一性很高;二、外生亲和试剂与光亲和标记;第五节 酶的化学交联;同型双功能交联剂两端具有相同的活性反应基团。 异型双功能交联剂的一端与氨基作用，另一端一般与巯基作用（羧基）。 可被光活化的高交联剂一端与酶反应，经光照，另一端产生一个活性反应基团（自由基）。它们具有高反应性，没有专一性。 可裂解型交联剂能将两条多肽链交联后，可用二硫苏糖醇等还原试剂切断交联的化学键，可用于多肽链的研究。 不可裂解型的化学交联，可用于固定化酶或修饰酶改善酶的生物化学性质和免疫学性质。;第六节 酶化学修饰的应用;一．化学修饰在酶的结构与功能研究中 的