08-3-核酸的研究方法.ppt

第八章 核酸化学 第一节.核酸概述 第二节.核酸的结构 第三节.核酸的物理化学性质 第四节.核酸的研究方法 一、核酸的分离、提纯和定量测定 （一）、核酸分离纯化原则 ①保持核酸一级结构的完整性； ②防止核酸的生物降解。 要求：尽可能保持其天然状态。 条件温和，防止过酸、过碱。 避免剧烈搅拌，抑制核酸酶。 （二）、DNA的分离 真核生物的染色体DNA与碱性蛋白质结合形成核蛋白（DNP）。DNP溶于水和浓盐溶液（如1mol/LNaCl），但不溶于生理盐溶液（0.14mol/LNaCl）。细胞破碎后用浓盐溶液提取，然后用水稀释至0.14mol/L的盐溶液可使DNP纤维沉淀出来。然后用苯酚或氯仿-异戊醇（辛醇）除去蛋白质。（均为变性剂） （三）、RNA的分离 RNA比DNA更不稳定，而且RNase又无处不在，因此RNA的分离更加困难。制备RNA通常需要注意3点：①所有用于制备RNA的玻璃器皿都要经过高温焙（bei）烤，塑料用品经过高压灭菌，不能高压灭菌的用具要用0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）处理，再煮沸以除净DEPC。DEPC能使蛋白质乙基化而破坏RNase的活性。②在破碎细胞的同时加入强变性剂（如胍盐）使RNase失活。③在RNA的反应体系内加入RNase的抑制剂（如RNasin）。 目前最常用的制备RNA的方法有两个： ①用酸性胍盐/苯酚/氯仿抽提。异硫氰酸胍是极强的蛋白质变性剂，它几乎使所有遇到的蛋白质都变性。然后用苯酚和氯仿多次除净蛋白质。此法用于小量制备RNA。 ②用胍盐/氯化铯将细胞抽提物进行密度梯度离心。RNA的密度大于DNA和蛋白质，沉在底部。此法可制备较大量高纯度的RNA。 另外，RNP（RNA＋蛋白质）易溶于0.14mol/L的盐溶液，根据此特性可以粗略的使DNA和RNA分离。 （四）、核酸含量的测定 核酸含量的测定常用的方法有紫外分光光度法、定磷法和定糖法。紫外以讲。 （1）定磷法 即钼蓝比色法，样品经浓硫酸或过氯酸处理，有机磷焙水解为无机磷，在酸性条件下正磷酸与钼酸作用生成磷钼酸，在还原剂存在下被还原成钼蓝，其最大吸收峰在660nm处，在一定范围内溶液光密度与磷含量成正比，据此可以计算出核酸的含量。 （2）定糖法 RNA与盐酸共热时核糖转变为糠醛，它与地衣酚（甲基苯二酚）反应呈鲜绿色，最大吸收峰在670nm。 DNA在酸性溶液中与二苯胺共热，其脱氧核糖可参与反应生成蓝色化合物，最大吸收峰在595nm。 二、核酸的超速离心（密度梯度离心） 将8.0mol/L的CsCl溶液装入离心管中，DNA样品装在离心杯的顶部，4.5万转以上离心。这时离心杯中将形成线性的CsCl浓度梯度，上小下大同时在离心力的作用下，DNA样品停留在与其密度相同的CsCl密度的位值。 三、核酸电泳 琼脂糖凝胶电泳，电泳完毕后，将胶在溴化乙锭中染色（0.5μg/mL）。溴化乙锭是扁平分子，易插入DNA的碱基对之间。DNA与溴化乙锭结合后，在紫外线照射下可发射橙红色的荧光，此法十分灵敏，1ngDNA即可用此法检出。 三、核酸电泳 （一）琼脂糖凝胶电泳 P516 与电泳迁移有关的因素 （二）聚丙烯酰胺凝胶电泳 DNA样品回收方法 四、核酸的核苷酸序列测定 DNA的酶法测序 一、DNA测序 DNA的化学法测序 用酶特异切断RNA链 二、RNA测序 用化学试剂裂解RNA 逆转录成cDNA 五、聚合酶链反应（PCR,P519） 聚合酶链反应 Polymerase Chain Reaction ,PCR 是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 　　PCR反应参数 95℃ 50℃ 引物1 引物2 DNA引物 PCR技术 50℃ 引物1 引物2 DNA引物 72℃ Taq酶 Taq酶 PCR技术 72℃ 第1轮结束 95℃ 第2轮开始 PCR技