补充基因分析技术概述.pptVIP

补充3 基因分析技术; 从20世纪中期DNA双螺旋结构的阐明到20世纪末人类基因组序列图的绘制。为深入研究基因与基因组的结构与功能，特别是疾病基因和疾病相关基因的结构与功能的研究，提供了关键的技术和手段。因此，基因分析技术成为21世纪主导生物医学技术的核心技术之一 利用基因分析技术可实现疾病的分子诊断，从DNA、RNA、蛋白质等生物分子水平上精确检测基因的序列、基因的表达与调控，探讨基因变异、基因表达差异与疾病发生发展的关系。近几年来令全球恐慌的SARS、禽流感等病原体基因结构和功能的快速揭示，正是应用了基因分析技术的结果。因此，可以预言基因分析技术新方法的进一步发展和完善必将成为推动现代医学快速发展的主要动力 ;第一节 聚合酶链反应技术 ;一、基本原理 ;变性(denaturation)：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA离解，使之成为单链，以便其与引物结合 退火(annealing)：温度突然降至37～58℃时，引物与变性的DNA单链(模板)在碱基互补的基础上形成引物-模板杂交双链（由于反应体系中引物浓度远远大于模板DNA浓度，且引物结构简单，这极大地限制了变性后模板DNA单链之问的互补结合） 延伸(extension)：在60～72℃时，Taq DNA聚合酶使引物从5′端向3′端按照碱基互补配对原则沿着DNA单链模板进行延伸，合成新的DNA互补链; 特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等;3.PCR产物量计算; ①理论上 PCR扩增效率应为100％，PCR产物随着循环的进行成指数形式增长[图16-2(a)] y=A*2n（y为产物量； A为起始模板量；n为循环数） ②实际上 PCR扩增产物的指数增加形式并不是无限制的。在PCR反应的后期，由于DNA聚合酶活性降低，模板拷贝数大量增加，引物及dNTPs量被大量消耗及模板互补链之间退火逐渐增加，PCR扩增效率下降，PCR产物的指数形式增长也逐渐变为线性增长直至出现平台(plateau)效应，即图16-2(b)为非指数形式增长 y=A(1+R)n（R为扩增效率） 计算PCR产物的量既要考虑到循环数，也要兼顾PCR扩增效率，在循环数和扩增效率已知的条件下，可通过y=A(1+R)n式估算PCR产物的?? ;二、反应体系 ;(二)PCR的反应要素;设计原则; TaqDNA聚合酶具有良好的热稳定性；在92.5℃、95℃和97.5℃时，其半衰期分别为130min、40min和5～6 min。Taq DNA聚合酶还具有良好的延伸效率，其生物学活性在75～80℃时最高，每一个酶蛋白分子每秒可延伸约150个核苷酸；往往70℃时，延伸效率为60个核苷酸／s以上。当温暖超过80℃时，该酶延伸速率明显下降，可能与引物或引物-模板遭到破坏有关 Taq DNA聚合酶没有3′→5′外切酶活性．缺乏校正功能，因此．对于PCR的忠实性要求很高时（如DNA测序、克隆DNA分子和DHPLC检测PCR产物等)，应使用Vent、Pfu等具有3′→5′外切酶活性的聚合酶，减少dNTP的错误掺入率，提高PCR的忠实性; 包括dATP、dTTP、dGTP和dCTP 在PCR反应中，要注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，否则会引起错配。浓度过高可加快反应速度，但也增加了碱基的错误掺入率和实验成本；反之，低浓度导致反应速度下降，但可提高PCR的忠实性和特异性; 一般组成为：50mmol·L-1KCl，10～50 mmol·L-1。Tris- Cl(室温pH8.3)，1.5 mmol·L-1MgCl2。KCl能促进引物退火，但过高浓度的KCl抑制Taq DNA聚合酶的活性。Tris缓冲液是一促双极化离子缓冲液，Tris-Cl主要用于调节pH，使反应体系偏碱性，以发挥Taq DNA聚合酶活性 另外，Taq DNA聚合酶是Mg2+依赖性酶（一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200 mmol·L-1时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol·L-1为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异性扩增；浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少） ;三、荧光定量聚合酶链反应 FQ-PCR;(一)荧光标记;;(1)Taqman技术 基本原理是利用Taq酶的5′外切酶性 基于Taq酶的此种特性，设计合成一个能与PCR模板/产物（相对的）杂交的探针，探针的5′端标记一个荧光分子，3′端标记另一个荧光分子，其中3′端的荧光分子能够吸收5′端荧光分子的荧光信号（荧光淬灭）；但当有特异的PCR产物时