分子生物学8-聚合酶链式反应.pptVIP

核技术 能量的放大;PCR技术 生命信息的放大;聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR） ;;;;;;Kary B. Mullis;一、PCR 的基本原理;;DNA的体内复制：;1、DNA模板变性;2、模板与引物退火;⑴引物短，不易缠绕； ⑵设计的引物是与模板DNA两端序列互补； ⑶引物的量远大于模板分子的量，引物与模板DNA形成双链的几率远远高于DNA分子自身的复性。 ;3、引物延伸;Taq DNA Polymerase (thermus aquaticus) ; 热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环 每一循环后的模板均比前一循环增加1倍。理论上讲，扩增DNA产量是呈指数上升的，即n个循环后，产量为2n拷贝。而实际上，PCR的扩增倍数为（1+X）n，X为扩增效率，平均为75% ;;;尽管PCR扩增DNA非常有效，但目的DNA序列的指数扩增并不是一个无限制的过程。 在正常的反应条件下，经30次循环之后，酶的催化反应趋于饱和，就会出现平台效应 (Plateau) ，产物的量不再增加。 “平台效应”出现的迟早还取决于酶的性能、模板DNA的拷贝数、dNTP浓度等多种因素。 ;;PCR原理回顾;二、PCR技术的特点;三、PCR基本反应;标准PCR反应体系与反应条件;2、以mRNA为模板的反应： 又称逆转录-PCR（reverse transcription-PCR,RT-PCR）3、PCR产物的积累规律4、PCR反应的自动化;PCR扩增仪;四、PCR条件的优化;1、模板核酸;模板的制备;2、引物;其它注意事项： ;;;; ;4、脱氧核苷三磷酸 (dNTPs) ;5、缓冲液 与Mg2+ ;6、PCR循环数;7、其它因素;PCR产物的电泳检测时间;PCR扩增产物的分析 ; ? M ? 1 ? 2 ? ? ;Detecting Products: ;假阳性;假阴性，不出现扩增条带;引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单 位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。;Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。 物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率；退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。 靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。;出现非特异性扩增带;出现片状拖带或涂抹带;非特异扩增 或 产物呈片状 ;五、PCR技术发展的主要类型;1)反向PCR (reverse PCR) ;已知序列;2）不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究; ;3）RT－PCR;;4）多重PCR：在一个反应体系中使用一对以上引物的PCR称为多重PCR。其结果是产生多个PCR产物，用于检测特定基因序列的存在或缺失。;5）实时定量PCR技术原理;;;原理和方法FQ-PCR的工作原理是利用Taq酶的5’→3’外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记探针。该探针可与引物包含