Chapter 14 基因工程.pptVIP

基因工程;第一节 概述;2. 发展 1971年　史密斯（Smith H. O.）等人从细菌中分离出的一种限制性酶，酶切病毒DNA分子，标志着DNA重组时代的开始。 1972年　伯格（Berg P.）等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和λ噬菌体DNA，将两种DNA分子用连接酶连接起来得到新的DNA分子。 1973年　科恩（Cohen S.）等进一 　　　　步将酶切DNA分子与质粒 　　　　DNA连接起来，并将重组 　　　　质粒转入E. cloi细胞中。 ;3.基因工程主要步骤 　①．分离和鉴定目的基因； 　②．构建的重组DNA分子：基因的体外重组； 　③．转基因技术：把重组DNA分子引入宿主受体细胞； 　④．筛选重组子：具有重组DNA的无性繁殖系或个体； 　⑤．外源基因在受体细胞中正常表达，翻译成蛋白质等基因产物、回收；或筛选出获得定向性状变异的个体。 ;第二节 植物基因工程;一、农杆菌介导的方法 （一）农杆菌的Ti质粒载体 质粒上一段DNA称为T-DNA（Transfer-DNA) ? 能转移并整合到植物基因组中 ;;;;;二、基因枪法 目的基因用金粉或钨粉包裹成直径1~4μm颗 粒，再利用基因枪以火药爆炸或压缩氦气为动 力将DNA颗粒以300~600m/s的速度打入植物细 胞。 ;;第三节 动物基因工程;;;二、显微注射法;显微注射示意图;;;获得转基因鼠的纯合鼠系;;1、电穿孔法： 通过短暂的高电场电脉冲处理细胞，沿细胞膜的电压差异会导致细胞膜的暂时穿孔。DNA被认为是穿过孔扩散到细胞内的。 2、磷酸钙转染： 最早在1973年开始采用。氯化钙+DNA+磷酸缓冲液按一定的比例混和，形成极小的磷酸钙-DNA复合物沉淀黏附在细胞膜表面，借助内吞作用进入细胞质。 ;3、脂质体法： 中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。 带正电的阳离子脂质体则不同，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。 ;4、DEAE-葡聚糖法： 带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体可以结合带负电的DNA分子，使得DNA复合物结合在带负电的细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克，也可能是细胞内吞作用使得DNA复合体进入细胞。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染，可重复性好，转染时要除掉血清。 ;通过胚胎干细胞获得转基因鼠;第四节 转基因检测;第五节 基因治疗;二、基因治疗的条件 1、对导入的基因及其产物有详尽的了解 2、外源基因有效导入受体细胞、稳定整合、 适量表达； 3、不能使受治细胞基因组及表达调控受影响； 4、导入基因方法安全，载体对靶细胞无害；;三、基因疗法的步骤 1、目的基因的选择： 根据基因治疗的类型选择相应的目的基因（增补、替换、添加） 2、基因载体的构建：使目的基因在受体细胞内高效、可控、稳定地表达 3、受体细胞的选择：容易分离获取，在体外增殖存活，大量扩增。如成纤维细胞、淋巴细胞、骨髓造血干细胞等。;四、导入的方式;2、体内导入（in vivo） 外源基因直接导入体内有关的组织细胞 使其进入相应的细胞 在细胞内表达 ;;