蛋白质技术剖析.pptVIP

酶联免疫吸附实验 酶标仪 免疫沉淀 利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。 抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合； 再与蛋白A/G（ProteinA/G）或二抗偶联的agarose或Sepharose珠子孵育； 离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物， 沉淀经过洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸5-10min，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离， 离心收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白 免疫沉淀 免疫沉淀 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 免疫沉淀 免疫沉淀 蛋白质分析技术 高效液相色谱 质谱分析 蛋白芯片 其他 高效液相色谱 高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。 高效液相色谱 “四高一广”的特点： 高压 高速 高效 高灵敏度 应用范围广 高效液相色谱 质谱分析 质谱分析是一种测量离子荷质比（电荷-质量比）的分析方法。 基本原理 样品各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的带正电荷的离子； 经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器； 质量分析器中，再利用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。 质谱分析 质谱分析 质谱分析技术在蛋白质研究中的应用 蛋白质序列分析 蛋白质分子量确定 蛋白质复合物的组分分析 蛋白质的修饰：硫酸化、糖基化、N段封闭等 HPLC Q-TOF 蛋白芯片 蛋白芯片是一种高通量监测系统，通过靶分子和捕捉分子相互作用来监测蛋白分子之间的相互作用。 捕获分子一般都预固定在芯片表面，由于抗体的高度特异性和与抗原强结合特性所以被广泛的用做捕获分子。 蛋白芯片 将各种蛋白质有序地固定于载玻片等各种介质载体上成为检测的芯片； 用标记了有特定荧光物质的抗体与芯片作用，与芯片上的蛋白质相匹配的抗体将与其对应的蛋白质结合，抗体上的荧光将指示对应的蛋白质及其表达数量。 在将未与芯片上的蛋白质互补结合的抗体洗去之后利用荧光扫描仪或激光共聚扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋白之间相互作用的关系，由此达到测定各种基因表达功能的目的。 蛋白芯片 蛋白质的四级结构 双抗体夹心法测抗原 双抗体夹心法测抗原 双抗原夹心法测抗体 双位点一步法 间接法测抗体 竞争法 捕获法 ABS-ELISA法 * * 等电聚焦电泳（IEF） 等电聚焦电泳（IEF） 蛋白质的分离纯化——所带电荷 电泳 在外电场的作用下, 不处于等电点状态的蛋白质分子将向着与其电性相反的电极移动。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 等电聚焦电泳 双向电泳 离子交换层析 是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法 带有正电荷的阴离子交换树脂 带有负电荷的阳离子交换树脂。 双向电泳（2-DE） 第一向：等电聚焦电泳 第二向：SDS电泳 电泳结果 蛋白质的分离纯化——所带电荷 电泳 在外电场的作用下, 不处于等电点状态的蛋白质分子将向着与其电性相反的电极移动。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 等电聚焦电泳 双向电泳 离子交换层析 是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法 带有正电荷的阴离子交换树脂 带有负电荷的阳离子交换树脂。 蛋白质的分离纯化——特殊亲和性 亲和层析法 利用蛋白质与配基之间特异性又可逆的结合这一特性，对蛋白质进行层析分离的技术。 常用配基 抗原——抗体 激素——受体蛋白 酶——底物（抑制剂） 层析载体常用琼脂糖凝胶等。 蛋白质的分离纯化——特殊亲和性 蛋白质浓度测定 凯氏定氮法 双缩脲法 酚试剂法（lowry法） 紫外吸收法 考马斯亮蓝法 蛋白质浓度测定 蛋白质浓度测定 蛋白质浓度测定 蛋白质浓度测定 蛋白质浓度测定 蛋白质浓度测定 蛋白质印迹实验（WESTERN-BLOT) 被检测物是蛋白质 “探针”是抗体 “显色”用标记的二抗。 蛋白质印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术。 蛋白质印迹实验（WESTERN-BLOT) 原理 蛋白质样品经过PAGE分离后，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上； 固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物