第三章吸附层析概述.pptVIP

2．流动相 在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体。在柱层析中又称为洗脱剂或洗涤剂；在薄层层析中又称为展开剂 6．洗脱体积(Ve) 是指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大值时的流动相体积。用Ve 表示(见图3-7中OB) 吸附剂的用量主要由吸附剂自身的操作容量和分离物中各成分的性质决定（一般为被分离样品的30-50倍）。 当操作容量小时，则吸附剂用量要大；另外，当样品中各组分的性质相似，难以分开时，应加大吸附剂的用量，有时甚至超过100倍。 ②将收集的每管溶液进行浓缩和活性测定。以管号或洗脱体积为横坐标，每管样品的浓度或活度为纵坐标，若层析峰无重叠，则各成分能完全分离（图3-7） ③为了获得满意分离效果，洗脱速度恰当控制（若太快，洗脱物在两相中平衡不完全；太慢，则洗脱物会扩散；结果都会导致分离度下降） ④分离出的样品经浓缩或冻干处理后，可进行纯度测定及保存 四、洗脱剂 条件 纯度较高 稳定性好 能较完全地洗脱下被分离的成分 黏度小 易和所需的成分分开 选择洗脱剂的顺序应从极性小 大 一般，pro或核酸被极性强的HA吸附后，要用含有盐梯度的缓冲液洗脱；而甾体、色素等化合物被极性较弱的硅胶吸附后，则可用有机溶剂洗脱。 五、层析柱的制备和层析操作 （一）层析柱 层析柱是下端为细口并带有筛板的玻管。柱子的直径与长度之比一般为1∶10-1∶40；吸附剂颗粒极细时，宜选用大比例（粗）的层析柱，反之用细层析柱，这样可节省时间和提高分辨率。层析柱的床体积由吸附剂的量和膨胀度决定 （二）吸附剂的用量 （三）装柱 1.干法装柱 直接加吸附剂至柱中，然后倒入溶剂，此法不易排尽气泡，容易导致层析不均匀 2.湿法装柱 先加适量溶剂至柱内，排走空气，然后将预先浸泡好的吸附剂搅均，随即将此混悬液倾入柱中（图3-5）；待其自然沉淀至柱高的1/4 - 1/3 时，打开下端出口，让溶剂慢慢流出，使柱子上端悬浮液徐徐下降至需要的高度；并用2-3倍量的洗脱剂流过层析柱，使其达到平衡 注：吸附剂表面要平整，应一直浸泡在溶剂液面以下，严防产生气泡。湿法装柱均匀，不易留有气泡 （四）上样和洗脱 ①经平衡好的层析柱，当平衡液到达固定相表面时，用滴管轻轻地将待分离样品液加置固定相表面（注意避免冲动基质，且样品液体积应小于床体积的1/2）；待样品液进入固定相时，用滴管加洗脱剂，并在上端连接洗脱剂瓶连续洗脱，同时下端与部分收集器接通，分级收集。 * * * * * 掌握吸附柱层析、薄层层析及聚酰胺薄层层析的基本原理和操作方法 层析方法的类型 加样操作示意图 第三章 吸附层析 层析又称为色谱或色层，是俄国植物学家茨维特在分离植物色素时发现并最先应用的一种分离纯化方法。其总的原理是根据各种被分离组分在固定相和流动相的分配系数不同达到分离的目的。 层析法根据层析类型分，可分为柱层析、纸层析和薄层层析；根据具体分离原理分，可分为吸附层析、分配层析、疏水层析、离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析等具体层析方法 吸附层析（absorption chromatography）又称色层法或色谱法；是根据各种被分离组分在固定相和流动相的分配系数不同达到分离的目的一类分离纯化方法。 吸附层析的概念 教学目的 掌握基本原理和操作方法 吸附柱层析 薄层层析 聚酰胺薄层层析 层析方法的类型 第一节 吸附柱层析 吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相制备成色谱柱，以有机溶剂或缓冲液为流动相，用于分离纯化的一种层析方法 。 吸附柱层析的概念 吸附层析的 固定相 极性:如羟基磷灰石、硅胶、氧化铝、人造沸石等 非极性：如活性碳等 流动相通常为有机溶剂或缓冲液 一、常 用 术 语 1．固定相 固定相是由层析基质组成的。其基质包括固体物质(如吸附剂、离子交换剂)和液体物质(如固定在纤维素或硅胶上的溶液)，这些物质能与相关的化合物进行可逆性的吸附、溶解和交换作用 3．层析 以基质为固定相(柱状或薄层状)，以液体或气体为流动相，使有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行分配、吸附或交换，最终使混合物得到分离的过程。 4．操作容量 是反映基质（固定相）对某种成分的结合能力的指标；它表示在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量，一般以每克(或毫升)基质结合某种成分的毫摩尔数或毫克数来表示。其数值大，表明基质对某种成分的结合力强；否则反之。 5．床体积(Vt) 是指膨胀后的基质在层析柱中所占有 的体积(Vt)。它是基质的外水体积(Vo) 和内水体积(