基因工程的基本原理和技术讲述.ppt

作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件及理由是( ) A、能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因 B、具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达 C．具有某些标记基因，以便为目的基因的表达提供条件 D、能够在宿主细胞中复制并稳定保存，以便于进行筛选 A 来源:主要是从原核生物中分离纯化出来的 4000种。 注：限制性酶是一大类酶，不是一种酶。 限制酶大多可以专一性识别双链DNA分子上的某种特定核苷酸序列， 限制酶所识别的序列，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线 粘质沙雷氏杆菌 被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。 其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。 载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。 1.1 DNA重组技术的基本工具 基因工程 基因工程又叫做DNA重组技术，或基因拼接技术。是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切” 和“拼接”，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的新的生物类型和生物产品。 对基因工程概念的理解： 基因工程别名： 操作对象： 操作环境： 原理： 操作水平： 目的： DNA重组技术或基因拼接技术 体外 基因重组 DNA分子水平 基因 定向地改造生物的遗传特性 (1)来源： (2)特点： 表现在两个方面: 识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列, 在特定核苷酸序列中的具有特定的切割位点。 这体现了限制酶具有专一性 (3)作用 切割DNA分子（DNA链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开） 1、限制性核酸内切酶----“分子手术刀” 主要来自原核生物 G A A T T C C T T A A G C C C G G G G G G C C C EcoRⅠ （4）作用结果： 产生黏性末端和平末端 SmaⅠ 　 EcoR Ⅰ 黏性末端　　　　 黏性末端 Sma Ⅰ 平末端　　　平末端 限制酶存在于原核细胞中的作用是什么？为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？ 要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？ 要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？ 会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。 思考? ……GAATTC…… ……CTTAAG…… ……GAATTC…… ……CTTAAG…… EcoRⅠ ……GAATTC…… ……CTTAAG…… ……GAATTC…… ……CTTAAG…… 不同来源的DNA片段混合 将不同种来源的DNA片段连接起来 生物A基因片段 生物B基因片段 ……G　　AATTC…… ……CTTAA　　G…… ……G　　AATTC…… ……CTTAA　　G…… 酶切 2、DNA连接酶——“分子缝合针” （1）作用: 把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来 催化磷酸二酯键形成，连接DNA片段 两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来 DNA连接酶的缝合作用 可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来， E·coli DNA连接酶　　　　　　　　或T4DNA连接酶 即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 　 T4DNA连接酶 （2）类型： 类型 E·coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 来源 功能 大肠杆菌 T4噬菌体 恢复 磷酸 二酯键 只能连接黏性末端 能连接黏性末端和平末端(效率较低) 相同点 差别 DNA聚合酶 DNA连接酶 区别 相同点 寻根问底 DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么? 只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键 催化形成磷酸二酯键 在两个双链DNA片段之间形成磷酸二酯键 A A T T G C A A T T A A T T DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶的作用 GAATTCCGTAGAATTCGGATT 尝试写出下列序列受EcoRI限制酶作用后的黏性末端 CTTCATGAATTCCCTAA GAAGTACTTAAGGGATT CTTAA