基因工程4.1PCR原理过程讲述.ppt

PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 72℃ 第2轮结束 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 重复30轮后 230=1,073,741,824 模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增 第4轮扩增 第5轮扩增 第6轮扩增 理想拷贝数=2n n 循环次数 实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 电泳分析 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 电泳分析 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 灵敏度高 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 病毒检测的灵敏度可达3个RFU 细菌检测的最小检出率为3个细菌 简便、快速 一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 扩增产物一般用电泳分析 对标本的纯度要求低 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA PCR的应用 研究 基因克隆，DNA测序，分析突变 诊断 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 人类基因组工程 遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 法医 犯罪现场标本分析 肿瘤 各种肿瘤检测 其他…… 1972，基因重组技术 1978，人类试管婴儿技术 1985，DNA扩增技术（PCR） 1990，人类基因组计划（HGP） 1997，哺乳动物克隆技术 影响深远的生物学技术 Polymerase Chain Reaction 聚合酶链反应 DNA体外快速扩增技术 PCR技术 PCR的故事 末代沙皇尼古拉二世、1918年的流行性感冒病毒(spanish flu)、电影《侏罗纪公园》，以及辛普森杀妻案，这四件事情到底有什么相关？没有。近十几年来生物技术的一项新发明，把它们给连在一块了。这项技术就是“聚合酶链反应”（polymerase chain reaction，PCR）。?? PCR技术简史 DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 DNA的变性与复性 变性 复性 加热 退火 1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。 但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了…… PCR技术简史 DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明PCR技术 原理是在试管中模拟DNA复制 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，这一过程耗时，费力，易出错 耐热DNA聚合酶的应用使PCR能高效进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪 1993年Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖 ?? PCR的发明人，一般公认是穆里斯（K. Mullis），他获得了1993年的诺贝尔化学奖。穆里斯在许多作品中，包括1990年在《科学美国人》上的一篇文章，及1998年的自传《心灵裸舞》（Dancing Naked in the Mind Field），都曾提到PCR这个构想的起源。 《科学美国人》（Scientific American）是一本科普杂志，是Science的姊妹刊,许多诺贝尔奖得主撰稿。 “顿悟” 那是在1983年春天的一个周五晚上，他开车带着女友前往乡间的小屋度周末。在蜿蜒的乡间公路上开着车，一段DNA反复复制的景像，在他的脑海里冒了出来。穆里斯原以为这样简单的想法，应该有人提出过，但有哪些信誉好的足球投注网站文献后却发现没有。 PCR技术的发明 PCR的发明是DNA操作技术的革命 美国Mullis教授 开汽车时的联想 逶迤崎岖的山路 行驶的汽车 1988年发明了PCR技术 1993年获诺贝尔奖 PCR技术 PCR技术简史 PCR的基本原理 PCR技术的应用 DNA体外快速扩增技术 一、PCR的原理与特点 PCR基本原理 在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。 变性 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 引物复性 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ P1 P2 延伸 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ P1 P2 再变性 再复性 P1 P1 P2 P2 再延伸 P1 P1 P2 P2 短片段以指数形式扩增 长片段以线性形式扩增 最终主产物片段长度在P1-P2之间 1、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂