狂犬病实验室检测技术精讲.ppt

狂犬病实验室检测技术 一、实验室操作前的要求及准备 二、实验室检测方法 实验室操作前的要求及准备 （一）实验室条件及生物安全操作要求 （二）检测标本的要求 （三）实验前准备 （一）实验室条件及生物安全操作要求 1、暴露前免疫 工作人员需要暴露前免疫 意外暴露于狂犬病毒时,必需立即报告部门负责人。 2、P2实验室 操作所有潜在狂犬病感染的材料均应在P2 或P3实验室内进行 (实验室固定毒在P2，病人或动物分离的街毒在P3）。 3、P3实验室 对动物标本进行狂犬病毒分离时，必须在P3 以上条件的专业实验室中进行。 没有P3 实验室，严禁从事狂犬病毒分离工作。 4、个人防护 实验前要穿戴好防护服、眼镜、手套， 作好技术上的准备。 5、防止气溶胶扩散 由于空气传播狂犬病毒已经得到证实，因此高速混悬或离心操作应在密闭状态下进行。 6、实验后消毒处理 实验后要作好善后消毒处理, 狂犬病毒对脂溶剂（肥皂水、醚、氯仿、丙酮），45～70%乙醇，碘制剂和四铵化合物敏感，操作完毕对操作台、实验材料等要用相应的消毒剂或高压蒸汽进行消毒处理。 1、采集时间 （1）应尽量采集较新鲜的标本。 （2）采集时无菌操作，避免标本污染 2、标本保存 （1）尽量低温保存 （2）存放于无菌离心管中并进行编号。 3、标本类型 （1）唾液、脑脊液、眼角膜、咬伤处皮肤组织、脑组织、血清等。 （2）唾液、脑脊液、眼角膜、咬伤处皮肤组织、脑组织等均可用于 病原学检测，其中以脑组织中的阳性率最高； 血清和脑脊液可用于抗体的检测。 （三）实验前准备 1、实验室及仪器的准备（略） 2、各种试剂及材料的准备（略） 实验室检测方法 （一）DFA 法 （二）巢式 PCR 法 （三）其它检测方法 （四）狂犬病诊断标准（WS281-2008）中的检测方法 （五）美国 CDC 狂犬病实验室操作手册中的检测方法 （一）DFA 法（直接荧光抗体法） ——检测狂犬病毒抗原 荧光抗体的染色方法可分为两类： 直接法 — 荧光抗体直接与标本内的抗原反应, 优点简便、快捷、有效减少非特异性染色, 只适用于检测细胞内的抗原； 间接法 — 荧光抗体作为第二抗体，与直接结合胞内抗原的第一抗体反应, 既可检测胞内抗原，也可以检测体液中的特异抗体 相对直接法操作步骤增多 DFA原理： 抗体蛋白分子 + + 抗原→形成抗原抗体复合物→通过荧光显微镜→检测抗原 荧光素 操 作： 1、材料和仪器 2、操作步骤 i. 印片： 用酒精浸泡载玻片 30 分钟后取出、吹干， 分别取不同部位的脑组织剖面, 均匀的涂印在载玻片上； ii. 固定： 吹干后，取冷丙酮（4℃）室温固定 7～10 分钟； 取出吹干，进行步骤3，或置于－ 70℃冰箱保存； iii. 加荧光抗体： 将稀释好的荧光抗体滴加在固定好的抗原片上 （如果从 冰箱中取出，则待雾气散掉后再进行此步骤。）； iv. 孵育： 将抗原片放在湿盒中， 37℃温育30 分钟； v. 洗片： 取出后，用缓流冲洗抗原片 3～5 秒， 再用 PBS 振洗 2 遍， 蒸馏水振洗 1遍，每次 2 分钟，吹干； vi. 封片镜检： 用 90％甘油（ PBS）封片，加盖玻片，荧光显微镜观察。 结果判断： 仔细观察每个视野的荧光强度，并结合不同视野 的荧光分布，作出荧光强度的等级判断：阴性、可疑、 ＋~ ＋＋＋＋ －：无荧光； ＋/－：极弱的可疑荧光； ＋：荧光较弱，但清晰可见； ＋＋：荧光明亮，且多个视野均有分布； ＋＋＋～＋＋＋＋：荧光闪亮，可见尼基氏小体清晰，且范围广泛； （二）巢式 PCR 方法——检测狂犬病毒核酸 传统的 PCR 检测模式一般需要三个步骤： 制备模板：对待测标本进行核酸（DNA或 RNA）提取 扩增过程：采用