X5土壤中尿素的细菌的分离与计数课题.ppt

专题二 微生物的培养与应用 土壤中分解尿素的细菌的 分离与计数 课题背景 尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。 土壤中的尿素分解菌能能合成脲酶 CO(NH2) 2 脲酶 + CO2 NH3 + H2O 本课题目的： ①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 ②统计每克土壤样品中含有多少这样的细菌 研究思路 （一）筛选菌株 （二）统计菌落数目 （三）设置对照 启示：寻找目的菌种时，要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 热泉70～80℃的温度，淘汰了绝大多数微生物，而Taq细菌被筛选出来。 DNA多聚酶链式反应(PCR)需要一种能够耐高温(约93℃)的DNA聚合酶。 筛选菌株 人为提供有利于目的菌株生长的条件(营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。 实验室中筛选微生物的原理 ①从物理性质看此培养基属于哪类？ 固体培养基 本课题使用的选择培养基的配方 ②此培养基中哪些作为碳源、氮源？ 碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素 如何验证此培养基具有选择尿素分解菌的作用？ 唯一氮源为尿素的培养基 牛肉膏蛋白胨培养基 接种相同、等量的菌液 菌落数少，形态较单一 菌落数多，形态多样 1、显微镜直接计数： 用血细胞计数板，在显微镜下计数一定容积里样品中微生物的数量。 不能区分死菌与活菌； 不适于运动和个体小的细菌的计数； 缺点： 统计(细胞)菌落数目 2、间接计数法（活菌计数法） 原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。 常用方法：稀释涂布平板法 每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。 注意事项 1、为了保证结果准确，一般选择菌落数在30-300的平板上进行计数。 2、统计的菌落往往比活菌的实际数目低。 3、为使结果更加准确，同一稀释度下涂布三个或三个以上的平板，计算菌落的平均数。 设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。 设置对照 实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。请分析其可能的原因。 原因： ⑴土样不同 ⑵培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质) 方案一：由其他人用与A同学相同土样进行实验 方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。 结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。 帮A同学设置对照组 1、土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 ◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。 2、制备培养基： 制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。 实验的具体操作 ◆应在火焰旁称取土壤10g。 ◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行 3、样品的稀释 ◆实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度等。 4、涂布平板 ◆分离不同的微生物采用不同的稀释度 稀释倍数 目的 细菌 104、105、106 保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板 放线菌 103、104、105 真菌 102、103、104 观察(计数)：每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 培养不同微生物往往需要不同培养温度 细菌：30～37℃培养1～2d 放线菌：25～28℃培养5～7d 霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。 5、培养与观察(计数) 如果得到2个或2个以上菌落数在30-300的平板，则说明稀释操作比较成功，能够进行菌落的计数。 如果同一稀释倍数下的三个平板的菌落数相差较大，表明误差比较大，需要重新实验。 微生物的特征鉴定 若培养物(培养基)被杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。 结果分析与评价 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂变红，说明该细菌能够分解尿素。 课外延伸 滤膜法测细菌的数目：将一定体积的水用滤膜过滤后，将滤膜放到伊红美蓝培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，根据培养基上菌落的数目，计算水样中大肠杆菌的数量。 练一练1.用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目，其