真核生物基因表达调控精讲.ppt

Why study protein expression? 采用突变分析技术，可以鉴定出半乳糖诱导基因的上游激活序列（upstream activation sequence, UAS），它们均含有一个或多个拷贝的17 bp序列，该序列被称为UASGAL。当把一个拷贝的UASGAL插入到TATA盒上游，TATA盒下游连接一个LacZ’报道基因，在野生型细胞中报道基因的表达受半乳糖的诱导，然而在gal4突变体中LacZ’基因不受半乳糖的诱导。这说明UASGAL是受转录因子Gal4激活的转录调控元件。 通过互补实验分离出GAL4基因。利用重组DNA技术，在大肠杆菌细胞中表达GAL4蛋白，发现Gal4蛋白与UASGAL序列结合。 10.3.2 转录因子的功能域 一系列的研究表明，Gal4蛋白有两种不同的功能域：DNA结合域（DNA-binding domain）与特异性的DNA序列相互作用；激活域（activation domain）与其他的蛋白质相互作用从而刺激从邻近启动子开始的转录。在这些实验中，研究人员检测了gal4的各种缺失突变对蛋白质的功能产生的影响。实验所用的受体细胞缺少GAL4基因，这样就可以排除内源的野生型Gal4蛋白对实验的干扰。 有关Gal4含有转录激活区进一步的证据来自结构域交换实验（domain swapping）。把Gal4激活结构域与大肠杆菌LexA的DNA结合结构域融合。LexA具有一个N-末端DNA结合结构域，该结构域专一性地与lexA操纵序列结合。在这些研究中，把一个报道基因引入酵母细胞，而报道基因的上游插入了lexA操纵基因。这时，报道基因并不表达。 接下来，把编码LexA DNA结合结构域的序列与编码Gal4激活结构域的序列连接在一起，构成一个融合基因，并把融合基因导入到酵母细胞。在细胞内，融合基因表达，产生的融合蛋白由来自于一个转录因子的DNA结合结构域和来自于另一转录因子的激活结构域构成。融合蛋白的DNA结合结构域结合到LexA操纵基因上，它的激活结构域激活报道基因的转录。所以，转录激活因子中的DNA结合结构域和转录激活结构域在序列上是彼此隔开的，彼此独立地折叠成不同的三维结构，并且可以独立地发挥作用。 10.3.2.1 DNA结合域 （1）螺旋－转角－螺旋结构域（helix-turn-helix domain) 与很多序列特异性DNA结合蛋白一样，螺旋－转角－螺旋蛋白也是以二聚体的形式与DNA结合的。二聚体的结合位点通常为反向重复序列，两个对称的单体分别结合到一个半位点上。 果蝇的同源异型基因（homeotic genes）对果蝇的胚胎发育十分重要。同源异型基因发生突变，会使果蝇身体的一部分转变成另一部分。同源异型基因编码的蛋白质都有一段保守的由60个氨基酸残基构成的序列，被称为同源异型域（homeodomain，HD）。同源异性域可以形成螺旋－转角－螺旋结构。具有HD的蛋白质是真核生物细胞中第一个被证实的螺旋－转角－螺旋蛋白，并且含HD结构的蛋白存在于从酵母到人类几乎所有的真核细胞。 （2）锌指（zinc finger） 锌指为蛋白质中一段相对较短的氨基酸序列围绕着中央锌离子折叠，形成的一种相对独立的DNA结合结构域。锌指得名于最初为阐明该结构域的外形而绘制的示意图：环形肽段围绕锌离子形成一手指状的结构，而锌离子则是形成和维持这一结构的关键。现在知道锌指有着不同的结构形式，也会出现在并不与DNA结合的蛋白质中。 C2H2型锌指 锌C2H2型锌指蛋白通常有串联排列的锌指，TFIIIA含有9个锌指，转录因子Sp1的DNA结合域由3个连续的锌指组成，每一锌指的α螺旋均嵌入DNA分子的大沟之中，以增强与DNA的亲和力。 C2C2型锌指 第二种锌指为C2C2型锌指。细胞内的类固醇激素受体（steroid receptor）首先被确定含有这种锌指，随后发现细胞内结构相似的非类固醇激素受体也含有这种锌指。因此，这类转录因子又通称为细胞核受体（nuclear receptor）。这类蛋白质的DNA结合结构域的共有序列是Cys-X2-Cys-X13-Cys-X2-Cys-X14–15-Cys-X5-Cys-X9-Cys-X2-Cys。 （3）碱性亮氨酸拉链（leucine zipper） 亮氨酸拉链最初是比较酵母转录激活因子Gcn4、哺乳动物转录因子C/EBP(CAAT框及SV40增强子核心序列结合蛋白)以及癌基因产物Fos、Jun和Myc的氨基酸序列时被发现的。这些调节蛋白的羧基端都存在一段富含亮氨酸的序列，易于形成α－螺旋。 在α-螺旋中，每7个氨基酸残基就会有一个亮氨酸残基，结果α-螺旋的某一侧面，每两圈就会出现一个亮氨酸，重复的亮氨酸数目一般为4～5个。α-螺旋中上的亲水氨基酸残基位