第四章基因克隆的载体讲课.pptVIP

2）端粒(telomere sequences, TEL) 定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的 DNA不被胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。 3）自主复制序列（ autonomous replicating sequence ,ARS） 一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNA 进行双向复制所必须的信号，是染色体自主复制的复制起点。 4）YAC 载体的选择标记 主要采用营养缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和组氨酸合成缺陷型基因 trp1、 leu2和 his3、尿嘧啶合成缺陷型基因 ura3 等，以及赭石突变抑制基因 sup4 。 但是YAC的一个突出优点是，酵母细胞比大肠杆菌对不稳定的、重复的和极端的DNA有更强的容忍性。 另外，YAC在功能基因和基因组研究中是一个非常有用的工具。由于高等真核生物的基因大多数是多外显子结构并且有长长的内含子，大型基因组片段可通过 YAC 载体转移到动物或动物细胞系中，进行功能研究。 F 质粒 ???? 大肠杆菌的 F 因子是一个约 100kb 的质粒。它编码60多种参与复制、分配和接合过程的蛋白质（Willetts and Skurray，1987）。虽然 F 因子通常以双链闭环DNA（1-2个拷贝/细胞）的形式存在，但它可以在大肠杆菌染色体中至少30个位点处进行随机整合（Low，1987）。携带F因子的细胞，或以游离状态或以整合状态表达三根发样状的F菌毛。F菌毛为供体与受体细胞之间产生性接触所必需。 细菌人工染色体载体 用于克隆DNA测序的 Sp6 、T7 启动子（来源于噬菌体）。 BAC载体特点 BAC 与YAC 和PAC（P1 artificial chromosomes ，P1 人工染色体 ）相似，没有包装限制，因此可接受的基因组 DNA 大小也没有固定的限制。大多数 BAC 文库中克隆的平均大小约 120kb ，然而个别的 BAC 重组子中含有的基因组 DNA 最大可达 300kb 。????F 质粒能够编码形成性菌的蛋白，通过大肠杆菌的结合转移可以进行遗传物质的转移。但是基因操作的时候一般不用这种自发的转化方式。外源基因组 DNA 片段可以通过酶切、连接克隆到 BAC 载体多克隆位点上，通过电穿孔的方法将连接产物导入大肠杆菌重组缺陷型菌株。 BAC 载体空载时大小约7.5kb ，在大肠杆菌中以质粒的形式复制。 BAC载体可以通过α互补的原理，筛选含有插入片段的重组子。 一个来源于大肠杆菌F 因子（致育因子）的严谨型控制的复制子 oriS ； 一个易于DNA复制的由ATP 驱动的解旋酶（RepE）; 三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座（parA、parB和parC）； 用于回收克隆DNA的NotⅠ(GC↓GGCCGC )酶切位点（位点十分稀少，重组子通过 NotⅠ消化后，可以得到完整的插入片段）； cosN位点可被入噬菌体末端酶切割为黏末端，因而能像传统的黏粒一样在克隆后包装 每个环状DNA分子中携带一个抗生素抗性标记(氯霉素抗性基因)； BAC 载体的低拷贝性可以避免嵌合体的产生，减小外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。 M13mp18 MCS M13mp19 MCS EcoRI BamHI HindIII PstI BglI BglI PstI HindIII BamHI EcoRI B P P B B P B P B P BamHI PstI M13克隆载体分子结构图 M13、f1、fd 优越性： 1.单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形的DNA为媒介的，这种复制形式的DNA简称RFDNA； 2. 不论是RFDNA还是ssDNA都能感染大肠杆菌； 3. 单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA的多少制约的，不存在包装限制问题； 4. 容易测定外源DNA片断的插入取向； 5. 可产生含外源片断的单链DNA分子。 单链DNA噬菌体载体 三、噬菌粒载体 由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列。 它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁