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植物基因工程真题（2011-2013） 一、名词解释 1、Southern blotting：是指通过吸附或电泳方法将经凝胶电泳分离的大分子物质从胶上转移到固相载体上，再与特定的探针反应从而达到检测或鉴定这些大分子物质的过程。 2、cis-acting element：顺式作用元件，存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列，包括启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等。它们的作用是参与基因表达的调控，本身不编码任何蛋白质, 仅仅提供一个作用位点, 要与反式作用因子相互作用而起作用。 3、subcloing: 4、Gene libray 5、Yeast Two-Hybrid Assays: 6、qRT-PCR 7. Shuttle plasmid vector 8. insert inactivation 9. cDNA library 10. RNAi 11. Gene knockout 12. Transduction and transfection 13. DNA probe 14. Enzyme-linked immunosorbent assay 15. Transpositional recombination 16. EST 17. Fluorescence in situ hybridization 18. q-pcr 19. SNP 二、简单题 1. Pcr反应原理和步骤；基本反应过程有哪些；反应体系与反应条件？简要介绍温度和时间设置间的关系？ PCR反应原理：DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 步骤：由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至（90-96℃）左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至（25-65℃）左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在（70-75℃）、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 标准的反应体系： 10×扩增缓冲液 　 5ul 4种dNTP混合物 　 各200μmol/L引物 　　　　 　 各10～100pmol　模板DNA 　　　 　 0.1～2μg　Taq DNA聚合酶 　 1～2 UMg2+　　　　　　 1.5～2.0mmol/L加双或三蒸水至 　 50μl 反应条件：为温度、时间和循环次数。 温度和时间设置间的关系：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。 ①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。 ②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度： 　　　　　Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+