常用分子生物学的原理及其应用详解.pptVIP

将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度； 待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。 PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性 。 （四）DNA序列测定 （五）基因突变分析 逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。 RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。 （一）逆转录PCR技术 三、几种重要的PCR衍生技术 * mRNA 5? AAAAAA(n) 3? mRNA 5? AAAAAA(n) 3? TTTTTT(n) 5? mRNA 5? cDNA 3? AAAAAA(n) 3? TTTTTT(n) 5? AAAAAA(n) 3? TTTTTT(n) 5? oligo(dT)12-18 反转录酶 RNase H DNA 聚合酶 S1 核酸酶 3? cDNA TTTTTT(n) 5? AAAAAA(n) 3? TTTTTT(n) 5? 反转录合成cDNA 原位PCR(in situ PCR)是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。 原位PCR方法弥补了PCR技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。 （二）原位PCR技术 （三）实时PCR技术 实时PCR(real-time PCR)技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR。 实时PCR技术原理 Q R 3 3 5 5 上游引物 下游引物 荧光标记引物 R Q 3 3 5 5 * （四）PCR结合免疫沉淀扩增 检测与蛋白质结合的DNA序列 7版 第四节 核酸序列分析 Nucleic Acid Sequence Analysis 核酸序列分析的基本原理： 化学裂解法 (Maxam-Gillbert法) DNA链的末端合成终止法 (Sanger法) 一、DNA链末端合成终止法 G A T C 测序反应 电泳 AACGTGGACT AACGTGGAC AACGTGGA AACGTGG AACGTG AACGT AACG AAC AA A 5 3 正极 负极 ddG ddA ddT ddC 链末端合成终止法测定DNA序列的原理 二、DNA自动测序 采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。 * DNA序列自动分析原理及结果图 ddG 红 ddT ddA 绿 ddC 蓝 橙 毛细管电泳 荧光标记 DNA合成 测序结果展示 第五节 基因失活技术 基因沉默(gene silencing)是指由外源基因导入引起的生物体内的特定基因不表达或表达受抑制的现象。 目前最常用的基因沉默技术包括： RNA干涉或者干扰（RNA interference，RNAi） 反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASON） RNAi是指双链RNA介导同源序列的mRNA特异性降解，导致的转录后基因沉默。 RNAi是机体的一种天然防御机制，具有防御病毒感染、入侵等功能。 目前利用RNAi能够在短时间内高效特异地抑制靶基因表达的特点研究基因的功能已成为功能基因组学的热点之一。 1. RNA干涉技术可用来研究基因的功能 RNAi的作用机制： 外源dsRNA可直接被导入细胞，或者通过转基因、病毒感染等方式进入细胞，并整合到基因组中获得表达；各种来源的dsRNA被核酸酶RNaseⅢ家族中，特异识别dsRNA的Dicer酶，以一种ATP依赖的方式逐步切割成长约21~23nt的双链小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)；siRNA识别mRNA链上的同源区域之后，结合一个核酶复合物形成RNA诱导的沉默复合体（RNA-induce silencing complex，RISC）；RISC定位到靶mRNA转录本上，并在距离siRNA 3’端12个碱基的位置切割mRNA。 RNAi的作用机制示意图 目前有5种方法可用于制备siRNA： 化学合成法 体外转录法 长链dsRNA的RNaseⅢ体外消化法 siRNA表达载体法 siRNA表达框架法