生化实验三.ppt

离子交换柱层析法分离氨基酸 TEAM 生化三组 华中科技大学 分离氨基酸的方法 1 of 13 生化三组 A沉淀法 B离子交换法 C萃取法 D吸附法 实验目的 1 of 13 生化三组 a学习离子交换树脂分离氨基酸的基本原理。 b掌握离子交换柱层析的基本操作。 c掌握氨基酸和茚三酮显色机理。 离子交换层析原理 2 of 13 生化三组 离子交换法是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换而达到分离目的的方法。离子交换剂是一类具有离子交换功能的高分子材料。因离子交换反应是可逆的，在一定条件下被交换的离子也可以“解吸”，使离子交换剂又恢复到原来的离子形式，所以离子交换剂通过交换和再生可以反复利用。 本实验采用磺酸型阳离子交换树脂分离酸性氨基酸天冬氨酸（Asp，pI2.97）和碱性氨基酸赖氨酸（Lys，pI9.74）的混合液。氨基酸是两性电解质，分子上所带的净电荷取决于氨基酸的等电点和溶液的pH值。在pH5.3条件下，因为pH值低于Lys的PI值，Lys可解离成阳离子结合在树脂上；Asp可解离成阴离子，不被树脂吸附而流出层析柱。在pH12条件下，因pH值高于Lys的pI值Lys可解离成阴离子从树脂上被交换下来。这样通过改变洗脱液的pH值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。 茚三酮反应机理 3 of 13 生化三组 茚三酮反应是指在加热条件下，氨基酸或肽与茚三酮反应生成紫色（与羟脯氨酸或脯氨酸反应生成（亮）黄色）化合物的反应。 该紫色化合物在570nm处有最大光吸收，所以可以利用分光光度计测量其含量。茚三酮显色反应受pH，茚三酮试剂的配制方法和浓度，氨基酸种类和浓度，反应温度，反应时间，冷却时间，离子强度等都有较大影响。该反应灵敏度高，目前已经广泛应用于氨基酸定性和定量的分析. 注意:pH对显色反应的影响特别大，且该反应在一个小时内稳定。 4 of 13 生化三组 仪器和试剂 仪器： 层析柱（20cm*1cm）；铁架台；恒流泵；部分收集器；分光光度计；移液枪；恒温水浴锅；试管；玻璃棒；烧杯；试管架 试剂： ①732型阳离子交换树脂 ②2mol/L氢氧化钠溶液，1mol/L氢氧化钠溶液 ③2mol/L盐酸溶液，0.1mol/L盐酸溶液 ④标准氨基酸溶液 ⑤洗脱液 柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲溶液（pH5.3） 0.01mol/LNaOH溶液（pH12）⑥显色剂 ⑦待测样品:混合氨基酸溶液 5 of 13 生化三组 树脂的处理 装柱 平衡 加样 洗脱 测定 树脂再生 6 of 13 生化三组 将1mol/LNaOH溶液浸泡的树脂用蒸馏水洗至中性（用pH试纸检测）然后用柠檬酸缓冲液浸泡。过剩的树脂浸入1mol/LNaOH溶液中保存，以防细菌生长。 1.树脂的处理 2.装柱 操作流程 取层析柱一支，垂直固定在铁架台上（先检漏）用夹子夹紧柱底出口处橡胶管，在柱内加2~3cm高的柠檬酸缓冲液，将搅拌成悬浮状的树脂沿漏斗缓慢倒入。待树脂在柱底部逐渐沉降时，慢慢打开柱底出口处铁夹，继续加入树脂悬浮液，直至树脂高度到层析柱高度的3/4处。 注意：要注意装柱过程的连续性，装好的层析柱应均匀，防止产生气泡，节痕或界面，否则会对实验有较大的影响，必须重新装柱；注意不要让树脂颗粒出现在层析柱管口，以免漏气。 7 of 13 生化三组 用柠檬酸缓冲液以1mL/min （20滴/min）的流速平衡进行，用pH试纸测量流出液pH，直至流出液的pH与缓冲液的pH相等。 注意：调节流速前要排除管内所有气泡，以免影响实验效果。调节流速时统一将流速调节为20滴/min,平衡时间一般为15分钟。接近平衡结束时将流速调为10滴/min作为洗脱速度。 3.平衡 4.加样 操作流程 用移液枪吸取氨基酸混合样品0.5ml，沿靠近树脂表面的管壁缓慢加入，使液体缓慢地流下至液体凹液面恰与树脂表面相平，立即关闭止水夹。再加0.5ml缓冲液，按照此法清洗2~3次。然后小心加入缓冲液离柱顶部1cm为止。注意：不要使液面下降至树脂表面以下。 8 of 13 生化三组 ① 缓冲液洗脱：用柠檬酸缓冲液（pH5.3）洗脱，收集1-10号管。② 0.01mol/L NaOH溶液（pH12）洗脱：收集11-40管。 注意：以6s/滴(10滴/min)的流速开始洗脱，用试管收集洗脱液，每管收集1ml（收集时间2分钟）在整个实验过程中要多注意层析柱，避免使柱内液体流干，否则实验即为失败；一定要让出液口对准试管，留心观察，有些仪器有偏差。 5.洗脱 6.测定 操作流程