SDS聚丙烯酰胺凝...pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 4.8%浓缩胶（5ml） 30%凝胶贮液 0.8ml 浓缩胶Buffer 1.25ml 蒸馏水 2.95ml AP 20ul TEMED 5ul 每小组1份 分离胶(15ml) 30%凝胶贮液5.75ml 分离胶Buffer 3.75ml 蒸馏水5.5ml AP 40ul TEMED 10ul 每小组1份 考马斯亮蓝G-250 50g硫酸胺 0.6gG-250 58ml磷酸 定容到400ml 再加100ml甲醇 每大组1份 （3）.样品处理 A、标准蛋白质样品marker B、用样品缓冲液配制1mg/ml的纯化蛋白质样品 C、制备复杂样品 取叶片1g，加5ml样品缓冲液研磨，过滤，12000rpm离心10min,取上清，备用。 将样品A、B、C都的沸水中加热10min,再置12000rpm离心10min,取上清，备用。 （4）制备分离胶 按比例配好分离胶,用移液管快速加入,大约5厘米左右,之后加少许蒸馏水,静置40分钟.※凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡.※水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面. （5）制备浓缩胶  倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置40分钟. ※样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平. （6）加样 拔出样梳后,在上槽内加入缓冲液,没过锯齿时可取下梳子. ※要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果.加样三个： A、5μl标准蛋白溶解液B、 5μl纯化标准样品C、制备的复杂样品10μl用微量注射器距槽底三分之一处进样,加样前,样品在  沸水中加热3分钟，去掉亚稳态聚合。 ※注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下  沉时会发生扩散. ※为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样. （7）电泳 A、浓缩胶15mA/胶 B、分离胶25mA/胶 到距离底部5mm处停止，取出胶 (8)固定染色与脱色 加固定液固定0.5h 水洗3次，每次15min 加染色液染色6h或过夜 水洗脱色至无背景 （9）测量数据 A、指示剂迁移距离 B、不同分子量蛋白质迁移距离 四、实验报告 １、实验名称 ２、时间、地点 ３、任课教师 ４、学生姓名、学号、分组 ５、实验目的 ６、实验原理 ７、仪器、试剂 ８、实验步聚 ９、结果及计算 １０、分析及讨论 1：Acr和Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作 用，操作时应戴手套 2：玻璃管表面应光滑洁净，蔗糖溶液封住管 底，否则会造成凝胶与玻璃管之间产生气 泡 3：尽量不要破坏胶面，否则样品区带不平整。 五、注意事项 4：并非所有蛋白质的分子量都可以用这种方法准确测定。一些电荷异常及带有大的辅基的蛋白质分子的分子量无法准确测定。 5：有多个亚基的蛋白质分子量在测定时要结合其它方法。 六、参考资料 张龙翔等，生化实验方法和技术（第二版），１９９７，高等教育出版社 中国科学院上海植生所编，现代植物生理学实验指南，科学出版社 ?张龙翔等， 生化实验方法和技术（第1版），1981年，高教出版社 郭尧君，蛋白质电泳实验技术（第2版），2005，科学出版社 http//:61.index.php 样品的浓缩效应：由于电泳基质的四个不连续性(即凝胶层的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性)，使样品在电泳开始时在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带(厚度为10-2cm)，而得以浓缩，然后再进行电泳分离。 浓缩效应 分子筛效应 　　分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同，因此表现出不同的迁移率，即所谓分子筛效应。即使净电荷相似，也就是说自由迁移率相等的蛋白质分子，也会由于分子筛效应在分离胶中被分开。 　此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时，小分子走在前面，大分子走在后面。而在柱层析方法中的分子筛作用，则是大分子通过凝胶颗粒之间的缝隙先流出，而小分子则通过凝胶颗粒内的孔道后流出。 电荷效应 　蛋白质混合物在凝胶界面处被高度浓缩，堆积成层，形成一狭小的高浓度的蛋白质区，但由于每种蛋白质分子所载有效电荷不同，因而迁移率不同。承载有效电荷多，泳动速度快，反之则慢。因此各种蛋白质就以一定的顺序排列戍一个一个的圆盘状。在进入