时间分辨荧光免疫分析重点.ppt

实例 加拿大Cyber Fluor的FIAgen系统 Eu3+-BCPDA为标记物 2. 传染病检测 梅毒螺旋体抗体检测：双抗原夹心法 强阳性血清和正常人血清分别作为阴阳对照 阴性对照、阳性对照和样品加入板上，孵育 加入铕标记抗原，孵育 加入增强液，检测荧光 符合中国药品生物制品鉴定所结果 3.糖尿病检测 C-肽检测：双抗体夹心法 抗体包被微孔板 加入标准品或样品 加入铕标记抗体 增强液，检测荧光 灵敏度：0.08ng/ml 4.激素检测 三碘甲状腺原氨酸（T3）：竞争法 微孔板中加入抗体 标准品或样品、铕标记T3 加入增强液，测定荧光 灵敏度：0.21ng/ml 5.细胞活性检测 测定细胞活性原理图 T：靶细胞 E：效应细胞 NK细胞活性 靶细胞：K562细胞 加入EuCl3, DTPA, 硫酸葡聚糖，4oC孵育 向靶细胞中加入效应细胞（NK细胞），孵育，离心，测上清荧光 计算比释放率（%） HCG：（human chorionic gonadotrophin）人绒毛膜促性腺激素；15年的努力，从仪器到试剂盒 * * 荧光衰减时间比常规荧光试剂长3-6个数量级 * * 最常用 * * 5-氟水杨酸磷酸酯（5-FSAP）；5-氟水杨酸（5-FSA） * 激发均为340 nm; Sm：钐。AFP：甲胎蛋白；hCG：人绒毛膜促性腺激素 * * CMV：巨细胞病毒，最常见的机会性感染性病毒；IgM：免疫球蛋白。可以消除IgG对IgM测定的干扰 * PAPP-A：妊娠相关血清蛋白，产前筛查 * K562细胞：人白血病细胞 * NTA：萘甲酰三氟丙酮；PTA：三甲基乙酰三氟丙酮。Eu:铕（有）。Sm:钐 (山)。Tb：铽（特）。Dy：镝 （笛）。 原子标记：体积小，标记后不会影响标记物的空间立体结构，可实现多个原子标记一个大分子。多标记技术：多种分子的同时检测 BCPDA： HBsAg：乙肝表面抗原 C肽：分子量越3K，可以用于判断用胰岛素治疗还是口服药物治疗。 5-2 时间分辨荧光免疫分析 郑鹄志 西南大学 化学化工学院 发展历程 1979年，可标记抗体的Eu3+-β-二酮体-EDTA 1983年，建立时间分辨荧光免疫技术，用于测定HCG和磷酸酯酶A “镧系元素时间分辨荧光分析技术及仪器的配套研究”获2003年度国家科技进步二等奖 一、时间分辨荧光免疫分析特点 1.荧光衰减时间长 镧系元素荧光衰变时间 常见荧光物质荧光寿命 荧光物质 荧光寿命 Eu3+ 714 μs 非特异性荧光背景 1-10 ns 人血清白蛋白 4.1 ns 人球蛋白、血红蛋白 3.0 ns 细胞色素C 3.5 ns FITC 4.5 ns 丹磺酰氯 14 ns 苯胺萘磺酸 16 ns 稀土螯合物 104 -106 ns 2. Stokes位移大 荧光物质 激发波长 发射波长 Stokes位移 Eu-(β-NTA)3 340 nm 613 nm 273 nm Sm-(β-NTA)3 340 nm 600 nm 260 nm Tb-(PTA)3 295 nm 490/543 nm 195/248 nm Dy-(PTA)3 295 nm 573 nm 278 nm 镧系元素发射峰窄 优点 灵敏度高（10-18mol/孔） 原子标记 多标记技术 二、时间分辨荧光免疫分析体系 非均相时间分辨荧光免疫分析 均相时间分辨荧光免疫分析 （一）非均相时间分辨荧光免疫分析 时间分辨固相免疫分析 解离增强荧光免疫分析 酶放大免疫分析 1.时间分辨固相免疫分析 灵敏度一般不高 2.解离增强分析 原理示意图 （1）双功能螯合剂 EDTA衍生物、DTTA衍生物、DTPA衍生物 一端与镧系离子螯合，一端与抗原/抗体连接 近中性时，螯合物足够稳定 酸性条件下，镧系离子迅速、彻底释放 Eu-DTTA应用最广泛 （2）增强液 增强原理图 一般增强百万倍 β-NTA：Eu(β-NTA)3(TOPO)2复合物 TOPO：荧光增强协同剂 Triton X-100：表面活性剂，形成胶束 醋酸：酸性介质 （3）酶放大 酶催化底物，生成的产物与溶液中镧系离子、螯合剂生成荧光强、寿命长的三元复合物 ALP 酶放大免疫分析示意图 双标记测定AFP和β-hCG β-NTA作为螯合剂 340 nm 激发，Eu:615 nm, 820 μs；Sm:643 nm, 88 μs （二）均相免疫分析 基于时间分辨荧光共振能量转移 无需洗涤、分离、加增强液 TBP-Eu：Eu3+-二吡啶二胺，最大发射615nm，供体 APC：别藻蓝蛋白，最大发射665nm，受体 能量转移效率最高的供体/受体对 时间分辨荧光共振能量转移免疫分析示意图 三、时间分辨免疫分析方法 夹心法 竞争法 间接法