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第七章 亲和层析 技术背景 一般纯化蛋白质、核酸等大分子物质的方法的主要依据是，各种大分子之间理化特性的差异性。 如果这种差异性较小，要得到一种纯度稍高的物质，常常需要进行多次繁琐的操作，耗费较长的时间，但最终收得率却是很低。 内容提要 第一节 基本原理 第二节 操作 第三节 提高吸附剂的操作容量 第四节 应用实例 第一节 基本原理 亲和层析的概念 亲和力 根据生物体中高分子化合物能与之相对应的专一分子特异识别和可逆结合的特征,将生物分子间的这种结合能力称为亲和力. 亲和层析法 利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性吸附而进行选择性分离的一种生物大分子分离的层析方法。 亲和层析法的实质 是在载体(无机或有机填料)的表面先键和一种具有一般反应性能的间隔臂,随后再连接配体（酶、抗原、激素等）组成固定相,而固载的配体高选择地吸附与其有生物特性的大分子而被保留,非特异的分子不被保留先流出层析柱,保留在柱上的分子将以纯品形态洗脱下来。 亲和层析的特点： 条件温和:不影响样品的生物活性,适合生物大分子的操作。 纯化效率高:一步法分离和纯化混合物中的样品,提纯达几千倍,得到高纯度样品。 选择性强:依据生物学特异性,而非物理化学性质分离原理.故特异的层析图为2个峰,第1个为杂峰,第2峰为纯品。 柱层析柱小 Vt＝1～1.5ml。上样量大,达 1/2Vt体积并对样品的浓度与纯度要求不高。 操作简单,时间快速。 柱子填充载体昂贵,配体的特异性,有时找不到适宜的配体,不适合所有生物大分子样品。 亲和层析的特点： 条件温和:不影响样品的生物活性,适合生物大分子的操作 纯化效率高:一步法分离和纯化混合物中的样品,提纯达几千倍,得到高纯度样品 选择性强:依据生物学特异性,而非物理化学性质分离原理.故特异的层析图为2个峰,第1个为杂峰,第2峰为纯品 柱层析柱小 Vt＝1～1.5ml。上样量大,达 1/2Vt体积并对样品的浓度与纯度要求不高。 操作简单,时间快速。 柱子填充载体昂贵,配体的特异性,有时找不到适宜的配体,不适合所有生物大分子样品。 内容提要 第一节 基本原理 第二节 操作 第三节 提高吸附剂的操作容量 第四节 应用实例 第二节 操作 一、理想基质的性质 结构是松散的多孔网络，利于大分子的流动与渗透； 颗粒均匀的球形，刚性好,不易溶性，操作压的变化不引起变形； 物理化学性质稳定； 化学性质是惰性，以降低非特异性的吸附； 带有丰富的化学基团易活化，以结合较多的配体； 高度亲水性，易与水溶液中的生物大分子结合； 抗微生物和酶的侵蚀。 具有实用价值的基质 纤维素：用于抗体与酶的纯化，如分离酪氨酸酶，酪氨酸酶的抑制剂连接到纤维素上，一步将酶纯化几百倍。 但其纤维性及非均一性限制了大分子的渗入;有非专一性吸附。 葡聚糖凝胶：良好的化学及物理稳定性，多孔性的结构利于生物大分子的分离。但其膨胀度变化大，应用受限制。 聚丙烯酰胺凝胶：物理化学性质稳定，抗微生物侵蚀,可提供很多供化学反应的酰胺基，提高配基的浓度。适合于配基和亲和物之间亲和力较弱的系统。但不易引入间隔臂，受到限制。 其它实用性基质 多孔玻璃：不受微生物的侵蚀，对有机溶剂和缓冲液的组成改变不敏感。保留表面含有羟基，在水溶液中显轻微负性的表面电荷，对酸性蛋白，病毒，多糖或核酸没有阻挡和吸附，而可以吸附所有的强碱性蛋白质和一些中性蛋白质及病毒。 琼脂糖：商品为Sepharose 2B,4B,6B表示2，4和6％的琼脂糖浓度的珠状凝胶。其化学性质的稳定性弱于葡聚糖和聚丙烯酰胺，热稳定性差，在pH4－9的环境使用，在一定浓度的酸碱不导致凝胶颗粒的变化，不被有机溶剂（乙醇，丙酮）引起收缩，能经受高浓度变性剂而不改变其吸附性能，故实用性广。 二、配基（配体）的选择 任何大分子或小分子蛋白、核酸（或其他分子）有特异结合的都可以作为配体；配体是有一定局限性，只能特异性地与某一种物质结合，而这种结合是可逆的，利用此性质可提取、纯化与配体特异结合的物质。 1.配体的选择 优良的配体必须具备两个条件： 配体与生物大分子具有合适的亲和力; 配体具有与载体牢固地结合,又不影响与生物大分子之间的亲和力。 配体的选择 固定在固相载体上的配体具有与目的蛋白能够选择性地结合并形成稳定复合物的能力。 复合物的稳定性取决于配体与蛋白质结合位点之间结合的紧密程度。 足够强的结合要求配体能够精确的嵌合在结合位点内。 解离常数的范围在10-5～10-8/M时适合于亲和层析过程。当解离常数﹥10-3 时，配体与蛋白质的结合力较弱，在层析过程中拉不牢目的蛋白，选择性过低;当解离常数 ＜10-15 时，亲和力太大，洗脱时得用激烈的和苛刻的、甚至是变性的条件。这对分离生物活性样品是忌讳的。 2.配体