04植物细胞工程制药说课.ppt

植物细胞培养中使用最多的碳源是糖类，对次级代谢产物的影响主要取决于所使用的糖类的种类及细胞次级代谢产物的生物合成过程。 碳源对长春花悬浮细胞培养中次级代谢作用的影响 次级代谢产物 糖类 乳糖（6%） 蔗糖（3%） 甘露糖醇（0.3~0.6 mol/L） 长春花碱/mg?L-1 蛇根碱/mg ? L-1 游离氨基酸/mol ? L-1 50 —— —— 16.60 1.40 0.55 —— 21.50 2.86 （4）植物生长调节剂 植物生长调节剂在植物细胞培养中起着非常重要的作用，这种作用有时可能是关键性的。但是植物材料和生理状态的差异，无一定的规律可循，必须通过仔细的实验观察才能确定其合适的数量和种类。 如Furuya在培养烟草细胞时发现，加入IAA时培养物中有尼古丁生成，但2, 4-D存在时则不合成该化合物。说明不同植物激素及其不同组合形式均可显著影响代谢产物的产生。 （5）O2和pH ① O2 ：培养细胞生长过程需要维持其正常呼吸作用，悬浮细胞培养和固定化细胞培养时供氧方式有所不同，前者可采用搅拌和通气方式，搅拌速度通常为120~160 r/min，过快易导致细胞破裂；后者仅能采用通气方式，一般使用含5%CO2的洁净空气，通气量应适当，过多或过少均影响细胞生长及次级代谢产物的合成。 ②pH：一般来说，最有利于培养细胞生长的pH在5~6之间。常用的培养基均具有一定的缓冲性质，在培养过程中培养液的pH变化较小。 （6）渗出物（exudates）：在细胞悬浮培养后期，培养液中常含有各种代谢产物，如某些初级代谢产物和次级代谢产物以及某些酸性物质、醇类、水解蛋白或活性蛋白等。如落花生悬浮培养细胞培养的后期培养液中含有27种多肽成分。 此外，培养细胞分泌产物的量也取决于培养物的发育阶段，如在多叶羽扁豆悬浮细胞培养中，在活跃的生长期初期，酶的分泌量就达到了稳定期的水平，然后酶活性随乙醇量的增加而降低。次级代谢产物的累积往往在水解酶活性增加之前进行。 2、两步培养法 培养基的组成是细胞生长和次级代谢产物的形成最直接、也是最重要的影响因素。为了得到最佳生长和最佳次级代谢产物，提出了两步法。 第一步主要使用适合细胞生长的培养基，称为生长培养基（growth medium）。 第二步主要用适于次级代谢产物合成的培养基，称为生产培养基。 两种培养基往往有较大的区别，前者是为了实现细胞的高生产率，后者通常具有较低含量的硝酸盐和磷酸盐，并含有较低的糖份或较少的碳源。 如长春花细胞培养中生长培养基与生产培养基的区别主要为前者使用了肌醇及维生素类成分，而后者则不含上述成分，在生长调节剂的使用上，前者应用2, 4-D刺激细胞生长，而后者加入6-BA以便利于次级代谢产物的产生。 3、诱导子 植物抗毒素（phytoalexins）是指在植物防御系统内能对抗微生物进攻的某些次级代谢产物（根据其功能又称为“后感染防御物质”）。尽管在有些情况下代谢产物可能会连续合成，但在另外一些情况下只有细胞被刺激时才能产生植物抗毒素，或仅在被诱导时其产量才能增加。 触发形成植物抗毒素信号的物质称为诱导子。从广义上讲，诱导子是能够诱导植物细胞中一个反应，并形成特征性自身防御反应的分子。 诱导子的分类有两种： 一种是根据在细胞内或细胞外形成而将其分为内源性诱导子和外源性诱导子。 另一种是根据其来源分为生物诱导子（biotic elicitors）和非生物诱导子（abiotic elicitors），现多采用后者。 生物诱导子是指植物体在防御过程中为对抗微生物感染而产生的物质，主要包括分生孢子（conidia），降解细胞壁的酶类、细胞壁碎片、有机体产生的代谢物等成分。初生细胞壁中富含由半乳糖醛酸组成的多糖成分，1%的浓度就足以诱导植物产生抗毒素，但其活性一般低于外源性?-庚糖苷。 非生物诱导子是指所有不是植物细胞中天然成分但又能触发植物细胞形成抗毒素信号的物质。生物诱导子和非生物诱导子在其量效关系上也有区别。 诱导子的类型与所产生的次级代谢产物的类型没有直接关系，各种生物合成途径所必须的酶也并不是对酶个诱导子的刺激都产生反应。 如在园欧芹悬浮细胞培养中，UV（非生物诱导子）对黄酮生物合成过程中所涉及的酶类有诱导作用，而在苯丙烷代谢中，只有生物诱导子才能与有关酶发生反应。 4、培养环境的外部因素 （1）温 度 培养物中次级代谢产物产生的最佳温度为20~28℃。在一定温度（≤15 ℃）下，细胞不再生长，次级代谢产物也不再产生。 但应该指出的是，在某些极端情况下（如30 ℃），细胞也能正常生长。终产物和中间产物的累积，甚