分离与纯化讲述.ppt

第九节 蛋白质 的分离与纯化 四、层析技术 层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”（Chromatography) 。 后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。 1944年出现纸层析。 以后层析法不断发展，相继出现气相层析、高压液相层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析等。 （一）层析的分类 按层析的分离机理分类 排阻层析(exclusion chromatography) 离子交换层析(ion exchange chromatography) 吸附层析(absorption chromatography) 分配层析(partition chromatography) 亲和层析(affinity chromatography) 金属螯合层析(metal chelating chromatography) 疏水层析(hydrophobic chromatography) 反向层析(reverse phase chromatography) 聚焦层析(focusing chromatography) 灌注层析(perfusion chromatography) （二）排阻层析 （凝胶层析） 凡是利用生物大分子的相对分子质量差异进行层析分离的方法，均称之为排阻层析。 用于层析的分离介质称为排阻层析介质。 凝胶层析介质主要是以葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等为原料，通过特殊工艺合成的层析介质。目前已成为生物化学、分子生物学和生物制药在研究和生产中必不可少的分离介质。 1、凝胶层析的特点及应用 特点：设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点。 用途：蛋白质(包括酶)、核酸、多糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。 2、凝胶层析的原理 凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。 概念（排阻层析，分子筛层析）：当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技术。 原理：凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。 3. 凝胶的种类和性质 (1)交联葡聚糖凝胶（Sephadex) 1) Sephadex G G 后的数字为凝胶吸水值的10倍。 G 反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围。 2） SephadeX LH—20，是Sephadex G—25的羧丙基衍生物，溶于水和亲脂性溶剂，用于分离不溶于水的物质。 (2)琼脂糖凝胶（Sepharose ; pharmacia;Bio-Gel(Blo-Rad) 依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结构越密集。 (3)聚丙烯酰胺 一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联而成。交联剂越多，孔隙度越小。 商品名为生物胶—P（Bio-Gel P). (4) 聚丙乙烯凝胶（Styrogel) 大网孔结构。 葡聚糖凝胶(Sephadex )的物理特性 4. 层析柱的重要参数 ⑴柱体积：柱体积是指凝胶装柱后，从柱的底板到凝胶沉积表面的体积。在色谱柱中充满凝胶的部分称为凝胶床，因引柱体积又称“床”体积，常用Vt 表示。 ⑵外水体积：色谱柱内凝胶颗粒间隙，这部分体积称外水体积，亦称间隙体积，常用Vo表示。 ⑶内水体积：因为凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有空间，液体可进入颗粒内部，这就分间隙的总和为内水体积，又称定相体积，常用Vi表示。 不包括固体支持物的体积（Vg）。 ⑷峰洗脱体积：是指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液的体积，常用Ve 表示。 当使用样品的体积很少时，（与洗脱体积比较可以忽略不计），在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用洗脱液体积为Ve。 当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时，洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰顶位置。当样品很大时，洗脱体积计算可以从应用样品开始到洗脱峰升高的弯曲点（或半高处）。  5. 凝胶过滤在试验室中的应用 1）生物大分子物质的分离纯化 2）分子量的测定 3）分级分离 4）溶液浓缩 5）平衡常数的测定 6）细胞及颗粒的分离 6. 分子量的测定 蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关: （三）离子交换层析 根据离子交换树脂对需要分离的各种离子的亲和力不同而达到分离的目的。 离子交换树脂通