HPLC培训(峰与色谱条件).pptVIP

HPLC 高效液相色谱 基本原理 加样 流动相 流动相 A C B B C A 固定相 —— 柱内填料，流动相 —— 洗脱剂。 HPLC是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达到分离的过程。 基本操作 1.打开泵电源，待自检完成后打开“Purge”阀进行排液以除去泵头之前的气泡，排气完成后关闭“Purge”阀。按“Pump”键开启泵，然后按“func”及数字键以0.2ml/min的速度慢慢将流速调1.0ml/min （其中测甘油果糖氯化钠注射液时应以0.1ml/min的速度慢慢将流速调0.5ml/min ）。 2.一般柱平衡时间为30min左右（测甘油果糖氯化钠注射液时平衡时间会更长些），此时依次打开检测器、工作站电源，打开计算机中工作站，待仪器自检连接完成后查看基线，如基线平稳即可进样采集数据。 3.检测完成后，关闭计算机中工作站、检测器、工作站电源，将泵的流速慢慢降至0.2ml/min，按“Pump”键关闭泵，将流动相换至10%甲醇水或乙腈水，再以1.0ml/min流速冲洗色谱柱30-60min。 4.最后将色谱柱充满纯甲醇保存。 5.手动进样器使用后，用适当溶剂冲洗进样阀，除去残留的样品，溶剂，缓冲盐等，盖好封盖防止灰尘颗粒。 流动相的配制 ①配制用水最好用蒸馏水（注射水） ②称量、量取、调pH时尽可能精确 ③流动相必须用0.45um滤膜过滤，注意区分有机膜、无机膜 ④加入甲醇或乙腈后要混合充分 ⑤流动相必须经过脱气（常用方法是超声脱气） ⑥配制所用的试剂尽可能用色谱纯，如没有色谱纯可用分析纯代替 ⑦流动相应现用现配制，染菌的流动相禁止使用 ⑧配制过程中应注意自我保护 流动相使用前为什么要脱气？ 流动相使用前必须进行脱气处理 ，以除去其中溶解的气体（如O2），以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。 常用的脱气方法比较： 氦气脱气法 加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。 抽真空脱气法：易抽走有机相。 超声脱气法：流动相放在超声波容器中用超声波振荡，超声过程中观察无气泡生成即可。 在线真空脱气法：真空脱机利用膜渗透技术在线脱气，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。 色谱柱的良好使用规范 溶剂使用前必须过滤 运输中变干了的色谱柱要完全浸湿（预处理） 如果样品中含有无需考虑而保留强的组分时,必须进行前处理 清楚了解色谱柱填料适用的pH范围(3-7)，温度(60),化学适应性 使用新鲜的水溶液,流动相现用现配制 定期用强极性溶剂冲洗色谱柱 储存色谱柱时,要将缓冲液冲洗干净,并保存在适合的溶剂中,如甲醇、乙腈 避免操作不当损坏色谱柱,如:猛敲,跌落或过紧拧接头 最常用的“万能柱”填料为“C18”，简称“ODS”柱，即十八烷基硅烷键