目的基因获得剖析.pptVIP

第三章 目的基因获取 教学目的 了解获得目的基因的一般方法。掌握基于基因文库分离基因的方法，核基因库以及cDNA库的构建及筛选方法。 重点与难点 基因组文库及cDNA库的构建 PCR方法筛选获得目的基因 常用方法 建立基因组DNA文库筛选目的基因 构建cDNA文库筛选目的基因 化学合成 聚合酶链反应（PCR） 方法扩增目的基因 其他方法 基因组DNA文库的类型 根据所选用的载体可以分为： 质粒文库、噬菌体文库、粘粒文库、人工染色体文库（细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库）。 基因组DNA文库的质量标准 一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件： 1重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力 2载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆 3克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序 4克隆片段易于从载体分子上完整卸下 5重组克隆能稳定保存、扩增、筛选 ３　基因文库构建的基本程序 （１）提取研究对象基因组 DNA ，制备合适大小的 DNA 片段，或提取组织或器官的 mRNA 并反转录成 cDNA ； （２）DNA 片段或 cDNA 与经特殊处理的载体连接形成重组 DNA ； （３）重组 DNA 转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌； （４）阳性重组菌落或噬菌斑的选择。 基因组DNA文库的构建流程 载体的制备 高纯度大分子量基因组DNA的提取 高纯度大分子量基因组DNA部分酶切和电泳分级分离 外源DNA片段的连接转化或包装侵染 重组克隆的挑取和保存 3.1 载体的制备 载体的好坏是影响连接成功与否的关键，载体的制备要 求两点，一是纯度高；二是去磷酸化好。 3.2 高纯度大分子量基因组DNA的提取和部分 酶切 构建不同大小插入片段的基因组文库对 DNA 质量要求 不同，一般所提取的 DNA 分子量至少应该是文库最终 平均插入片段长度的 3～5 倍。实践表明，提取的基因 组 DNA 分子量越大，所得到的重组克隆的插入片段越大。 3.3外源DNA片段的连接转化或包装侵染　 　　将一般在构建大片段基因组 DNA 文库时，大量连接前都要先使用小体系连接来寻找最适的比例。在电转化和包装侵染过程中，首先最好选择转化效率高的进口感受态细胞或效价高且质量稳定的包装蛋白，同时，研究表明对连接产物进行脱盐处理也可以明显地提高其效率。另外，对于电转化而言，选择合适的转化电压对不同插入片段的 DNA 的转化效率也有所不同。 3.4 文库的质量检测 ?? 在文库的质量检测中，除了克隆子数目是可以确定的，其它值都是估算的。文库的平均插入片段长度是通过电泳检测一定数目的重组子的插入片段大小所得平均值。一般要求植物的在 130kb 左右，而动物的在 150kb 左右。 插入效率也是通过此法检测的，表示有插入片段的克隆在所有检测的克隆中所占的比例。 基因组覆盖度是指文库中的克隆覆盖基因组的范围，检测时是通过选择一定数目的已知的单拷贝的基因作探针来筛选文库。 ４原核生物基因组DNA文库的构建 （一）原核生物基因组DNA的提取 染色体DNA 质粒DNA 要求：制备的DNA的长度为100-200kb，防止在制备过程中的机械断裂 （二）基因组DNA的不完全酶切 1、根据实验需要选择合适的限制性内切酶 a) 四个识别位点的限制酶出现的几率: 1/256 b) 六个识别位点的限制酶出现的几率: 1/1024 2、分离目的酶切片段大小的确定 a) 克隆单个基因： 10 kb b) 克隆基因簇： 20kb 3、DNA不完全酶切条件的确定 a) 确定限制酶用量，改变酶切时间 b) 固定酶切时间，改变限制酶的用量 DNA的不完全酶切 （三）酶切片段与克隆载体连接 １、酶切片段的分离与纯化 　　１）低熔点琼脂糖回收目的片段 　　２）试剂盒回收目的片段 2、酶切片段与克隆载体连接克隆载体的选择　 a）质粒载体可承载15kb DNA左右片段 (有效的范围为10kb) b）?载体可承载25kb DNA左右片段(有效的范围为15 kb) c）Cosmid 载体可承载45kb DNA左右片段(有效的范围为40 kb) （四）重组ＤＮＡ转化受体细胞 １、根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞 　　常见的宿主细胞： DH5?:　用于铺制与培养质粒平板和粘粒平板的重组缺陷 　　　型的抑制型菌株，可与PUC编码的?－半乳糖苷酶氨基端实现?互补。 HB101: 用于大规模制备质粒的抑制型菌株，转化效率高 JM101: 可支持带有琥珀突变载体生长的宿主菌 JM109: 支持带有琥珀突变