五胚胎工程剖析.ppt

试管小鼠(Whit-tingham，1968) 大鼠(Toyoda和Chang，1974) 婴儿(Steptoe和Edwards，1978) 牛(Brackett等，1982) 山羊(Hamda，1985) 绵羊(Hanada，1985) 猪(Chang等，1986) 牛（Parrish等，1986） 体外受精技术主要包括以下几个主要方面：精子的采集与获能、卵子的回收及成熟培养、体外受精、受精卵的体外发育及试管胚胎的移植等。 1. 精子的获能处理 张明觉Austin 1951年发现兔子和大白鼠直接排出的精子不能使卵受精，必须在生殖道中停留一段时间后才具备受精能力，这一现象称为精子的获能（capacitation）。 精子的获能过程是多时期、多步骤的复杂变化过程，包括两个阶段，获能的第一阶段是脱出精子表面的抗原物质和去能因子（Decapacitation Factors，DF），增强了膜通透性。第二阶段是精子细胞膜蛋白变化，即发生顶体反应。 2. 卵母细胞的采集和成熟培养 （1）卵母细胞的采集 ①超数排卵 ②从活体卵巢中采集卵母细胞 ③从屠宰后母畜卵巢上采集卵母细胞 （2）卵母细胞的选择 （3）卵母细胞的成熟培养 3. 体外受精 （1）常规体外受精技术 将获能精子与成熟卵子置于受精液中共同培养，使之完成受精过程。通常情况下，受精液与获能液为同一种液体。 （2）与分离精子相结合的体外受精技术 将精子分离技术与体外受精技术结合起来生产预选性别的优良胚胎, 对加速家畜品种改良和畜牧业生产具有重要的应用价值。 （3）显微受精技术 为了提高体外受精的成功率，借助显微操作仪将精子直接注入卵母细胞质或透明带下，完成受精过程。显微受精技术避免了由透明带或卵质膜所形成的受精障碍，使受精率和准确率大大提高。 4. 受精卵的体外培养 受精卵需要在培养液或输卵管中发育到桑葚胚或囊胚阶段，移植到受体后才能获得较高的妊娠率。但体外受精的早期胚胎在体外发育过程中，往往会停滞在某一阶段不再发育，此现象称之为“发育阻滞”。不同动物体外发育阻滞出现的时期不同，小鼠为2细胞期，大鼠为8细胞期，牛和绵羊为8~16细胞，猪为4细胞期。 目前，克服阻滞现象主要采用以下两个方法： 一是改进培养液成分，改善培养条件，尽量满足早期胚胎发育所需物质，确定并减除对其发育不利的成分； 二是利用体细胞共同培养体系，以提供发育所需的物质条件，目前广泛采用的有输卵管上皮细胞共培养体和颗粒细胞单层共培养体系。 5 . 体外受精的意义 家畜体外受精技术经过近20年的发展，已取得很大进步，为实现动物胚胎的工厂化生产提供了可能，对充分发挥良种母畜的繁殖潜力，加快家畜品种改良和优良品种遗传资源的开发与利用,加速畜牧业的发展具有重要的科学意义和实用价值。 复习题 1.名词解释：胚胎移植，超数排卵，同期发情，胚胎冷冻。 2.超数排卵常用的激素有哪些？ 3.胚胎移植的原则是什么？ 4.简述胚胎移植的方法、程序及操作过程。 5.简述胚胎的质量鉴定及分级方法。 6.常用的胚胎采集方法有哪些？ 7.常用的胚胎冷冻方法有哪些，之间有什么区别？ 8.冷冻胚胎的质量如何判定？ A级（可用）： 形态正常，卵裂球致密、整齐、清晰，发育阶段与日龄一致，无游离的细胞和液泡或很少，变性细胞比例＜10%。 B级（可用）： 卵裂球稍显不匀，致密、整齐，有游离细胞和液泡，变性细胞占10%～30%。 C级： 卵裂球不匀称，变形，发育较慢，游离细胞或液泡较多，变性细胞达30%～50%。 D级： 卵裂球多数变形、异常，发育缓慢，变性细胞占胚胎大部分，约75%。 六、胚胎移植 手术法移植 非手术法移植 （一）牛的胚胎移植 1．手术移植 先将受体母牛做好术前准备。在右腹部切口，找到有黄体侧子宫角，再把吸有胚胎的注射器或移卵管刺入子宫角前端，注入胚胎，然后将子宫复位，缝合切口。 2．非手术移植 一般于在发情后第6～9d进行，过早移植会影响受胎率。 工具：胚胎移植枪 0.25mL细管 方法： 将细管截去适量，吸入少许保存液，吸一个气泡，然后吸入含胚胎的少许保存液，再吸入一个气泡，最后再吸取少许保存液（培养液-气泡-含胚胎培养液-气泡-培养液）将装有胚胎的细管装入移植枪内，通过子宫颈插入子宫角深部，注入胚胎。 图14-6 牛非手术胚胎移植装置示意图 A.移植枪塑料外套钝金属头(两侧带孔)；B.移植枪塑料外套；C.移植枪套管；D.移植枪套芯；E.液段；