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血凝、血凝抑制实验 Hemagglutination test, HA  Hemagglutination Inhibition test, HI 血凝（HA）与血凝抑制实验（HI） 一、实验目的 二、实验内容 三、实验原理 四、实验材料 五、实验方法与结果判定 六、注意事项 一、实验目的 掌握血凝和血凝抑制试验的基本原理、操作方法和结果判定方法。 可用来检测家禽血清中的感染或免疫抗体。 血凝试验：滴定病毒的血凝效价(病毒的凝集价)，采用一定的病毒量，通常采用4个血凝单位。 血凝抑制试验：应用标准病毒液测定血清中的相应抗体或应用特异性抗体鉴定新分离的血凝性病毒。 二、实验内容 1、血凝试验(HA禽流感抗原效价测定 2、血凝抑制试验(HI)检测禽流感抗体效价测定 1、血凝试验（HA）原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物地红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（HA）,也称直接血凝反应。 2、血凝抑制试验（HI）原理：当病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI）反应，也称血凝抑制反应。 四、实验材料 1、血凝板（90度） 2、禽流感阳性血清 3、被检血清 4、1％红细胞悬液 5、稀释液 6、移液器 7、枪头 仪器及诊断液等的准备 96孔90°V型微量反应板、微量移液器、生理盐水 、1％鸡红细胞悬液、待检血清、阴阳性血清、病毒抗原。  稀释禽流感病毒H5亚型抗原：吸取本抗原规定剂量加入生理盐水稀释好备用。 稀释禽流感H5亚型标准阳性血清：吸取本血清规定剂量加入生理盐水稀释好备用。 待检血清要新鲜、无杂质、无红细胞、不腐败，盛血清的容器要清洁。注意：所有试剂及待检血清在试验前必须恢复室温，且室内温度保持在（20-25 ℃） 五、实验方法与结果判定 禽流感血凝试验（HA) 1、在血凝板上第一排的1－12孔内各加入50ul生理 盐水 2、在第1孔内加入50ul病毒抗原，然后依次倍比稀释至第11孔，最后弃50ul 3、每孔加入1％鸡红细胞悬液50ul 4、轻轻振荡均匀，后放于室温或37℃中静置30分钟 5、结果判定 血凝效价测定 血凝试验结果判定 本实验的抗原凝集价为1024，该稀释倍数含一个血凝单位的抗原 * * 1%鸡红细胞悬液的配制： 采集至少3只SPF公鸡（非免疫的公鸡）或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积阿氏液混合（4℃可保存7天左右）。配制前用PH 7.2的生理盐水洗涤3次每次均以离心机上1500-2000r/min (不得超过2000r/min，否则会导致红细胞破裂，引起溶血)，离心10分钟左右。洗涤后，吸取沉积于管底的红细胞泥1mL，混合于99mL生理盐水中混匀。即得1%RBC。4℃可保存3天左右，若出现溶血应重新采血，重新配制。 三、实验原理 凝 集 红细胞 抗原 凝集反应 红细胞 不凝集 不凝集 HA试验原理 红细胞 抗原 凝集抑制反应 抗体 血凝抑制 HI试验原理 红细胞 抗原 不抑制 不抑制 ＋ ＋ ＋ 50 50 50 256 × 8 ＋ ＋ 50 50 50 512× 9 － 50 50 50 1024 × 10 － 50 50 50 2048 × 11 红细胞对照 128 × 64 × 32 × 16 × 8 × 4 × 2 × － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋＋＋ ＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ 结果 50 50 50 50 50 50 50 50 红细胞 弃50 50 50 50 50 50 50 50 抗原 50 50 50 50 50 50 50 50 生理 盐水 12 7 6 5 4 3 2 1 1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100％凝集； 2、＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而稍向孔底集中，即75％凝集； 3、 ＋＋ ：红细胞形成一个环状，四周有凝集块，即50％凝集； 4、 ＋ ：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四周稍有凝集块，即25％凝集； 5、－ ：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即无凝集； ++++ +++ ++ + - 禽流感血凝效价的判定 以出现＋＋（50％凝集,出现流泪）的抗原最高稀释倍数为该抗原的血凝价（1:512）。 平面观察 45°角观察 禽流感血凝抑制试验 1、将病毒抗原稀释成4个血凝单位和2个血凝单位（1/1024×4=1:256，1/1024