高效液相色谱2013.ppt

HPLC主要部件 HPLC主要部件 (2)梯度淋洗装置 (2) 进样阀 基质类型 化学键合反相固定相 检测器－色谱系统的眼镜 紫外检测器（通用型、较高灵敏度） 荧光检测器（选择性、高灵敏度） 示差检测器（通用型、低灵敏度） 蒸发光散射检测器（通用型、较高灵敏度） 质谱检测器（通用型、高灵敏度） 液相色谱检测器 液相色谱检测器 光电二极管阵列检测器 示差折光检测器（refractive index detector） 荧光检测器（fluorescence detector） 20℃ 1.4603 四氯化炭 20℃ 1.3286 甲醇 20℃ 1.501 苯 20℃ 1.496 甲苯 15℃ 1.463 四氯化炭 18℃ 1.446 氯仿 20℃ 1.427 乙二醇 25℃ 1.404 四氟呋喃 18℃ 1.362 乙醇 20℃ 1.375 乙烷 20℃ 1.358 丙酮 20℃ 1.333 水 温度 折光指数（RI） 溶剂 ? 高灵敏度、高选择性 对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应 空间排阻色谱(Size Exclusion Chromatography) M.W. tR 基本原理：利用多孔性物质对不同大小分子的排阻作用进行分离 适用分析对象：高分子聚合物 高效液相色谱High performance liquid chromatography, HPLC 基本概念 基本分类或模式 HPLC的特点 基本组成 基本内容　　　 HPLC 液相色谱流程图 PUMP Detector W 泵 分离柱 检测器 进样阀 采用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入色谱柱进行分离测定的色谱方法。 适用对象： 高沸点、热不稳定有机及生化样品 一、概 述 分析对象 流动相差别 GC 能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，占有机物的20% 惰性气体 HPLC 不受样品挥发性和热稳定性的限制，占有机物的80% 液体，种类较多，选择余地广 HPLC与GC区别 一、概 述 HPLC经典LC ~10 0.5h - day 分离时间 50-200 1-10 操作压力, atm 3-7 150-200 填料粒度，um 15-30 50-100 长度，cm ~ 0.4 1-5 内径, cm HPLC 经典 参数 ◇ 三高 ◇ 一广 ◇ 一快 由于液体与气体性质的以下差异： 溶质在液体中的扩散系数比它在气体中小105倍左右 液体粘度比气体约大102倍 液体表明张力比气体大104倍左右 液体密度比气体约大103倍 液体不可压缩 二、影响分离的因素 二、影响分离因素 H = A + B/u + Cu λ↓ 球形固定相，高压、匀浆装柱法 dp↓选粒径小的化学键合相 C↓ 选粘度小、低流速的流动相 柱外效应 又称柱外谱带扩展，是指色谱柱之外的造成色谱峰展宽的因素。 是指从进样点到检测池之间除柱子本身以外的所有死空间。　 主要由进样装置、检测池及它们与柱之间的连接管路所产生, 尽可能地减小柱外效应也是HPLC仪器制造技术革新的不断追求 实验表明进样阀引起的柱效增加效果非常显著, 柱外死体积减小后柱效增加134倍、分离度提高116倍 ?2柱外＝?2进样+ ?2连接管+ ?2接头+ ?2检测池+ ?2其它 中心进样 池体积匹配 柱外效应标志？ 比例因子 X1/X2= (D1/D2)2 D- column diameter X stands for flow rate, the volume of flow cell 流动相为有机相 流动相为缓冲溶液 分析对象不同 分离机制：疏溶剂理论等 固定相：非极性键合相 如:十八烷基硅烷键合相（ODS；C18柱) 流动相：极性流动相 如:甲醇-水或乙腈-水或四氢呋喃－水 样品极性与k的关系: 　 极性↑，保留时间↓ 应用范围：非极性--中等极性组分(80%) 反相色谱 (RP-HPLC) 反相色谱 RPLC 固定液极性 流动相极性 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 分离机制：定向作用力、诱导作用力、或氢键作用力的差别 固定相：极性固定相 如氰基或氨基 流动相：非极性溶剂（如正己烷）+ 极性调节剂（乙醇、四氢呋喃） 流动相极性与k的关系： 　　流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓ 　　结构相近组分，极性大的组分后出柱 应用范围：极性组分　(20%) 正相键合相色谱法(NP-HPLC) 正相色谱 NPLC 固定液极性 流动相极性 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 HPLC流动相选择原则 保持色谱柱的稳定性 化学惰性 适合所用的检测器 对样品有一定的溶解能力 清洗、