聚合酶链反应1.ppt

第七章 聚合酶链反应(polymerase chain reaction ,PCR) 基本原理： 一、PCR的基本原理 示意图 二、PCR引物设计 PCR反应成功扩增的一个关键条件在于引物的正确设计。引物设计的总原则就是提高扩增的效率和特异性。其效率和特异性取决于两个方面，一是引物与模板的特异结合，二是聚合酶对引物的有效延伸。 PCR反应中有两条引物，即5′引物和3′引物。设计引物时，通常以信息链为基准，5′引物与位于待扩增片段5′上游的一小段DNA序列相同，以信息链的互补链为模板，引导信息链的合成，3′引物与扩增片段3′端的一小段DNA序列互补，引导互补链的合成。PCR反应扩增的就是这一对引物之间的DNA片段。 （一）PCR引物设计原则 1、引物长度一般为15~30个核苷酸。引物过短会使PCR的特异性降低，过长会提高相应的退火温度，并使延伸温度超过TaqDNA聚合酶的最适温度74℃,亦会影响产物的生成，且合成引物的成本增加。 2、引物中的碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶的堆积现象。尤其是引物的3′端不应有连续3个G和C。否则会使 引物在模板的G+C富集序列区错误配对。引物中G+C的含量 在45~55%左右。设计引物时要考虑3′端和5′端 引物具有相似的Tm值。Tm=4（G+C）+2（A+T）。引物长度要确保解链温度不低于54°C 3、引物自身内部不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。按经验，引物自身存在的连续互补序列，一般不超过3bp。 4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3′端的互补重叠。 5、引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。尤其是引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。 6、引物3′端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物3′端的最佳碱基选择是G和C。因为它们形成的碱基配对比较稳定。 7、引物的5′端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素，荧光物质，地高辛标记，加入其它短序列包括起始密码子，终止密码子等。在PCR的起始反应中，引物5′端游离的碱基并不影响引导新生链DNA合成的能力。但在后续的扩增循环中，这些与初始模板不配对的序列被带到PCR产物的双链中去，所以如此引物参与的PCR产物，既含有目的扩增片段又含有两侧引入的核苷酸序列。 （二）引物设计的方法 现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，(在线引物设计的网站有： http://cbr-rbc.nrc-cnrc.ca/cgi-bin/primer3–www.cgi; /cgi-bin/SGD/web-primer; http://bioinformatics.weizmann.ac.il/cgi-bin/primer/primer3.cgi; /~urolab/methprimer/index1.html; /rawprimer.html)得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以“Oligo 6”最为优秀；其次是引物的自动有哪些信誉好的足球投注网站功能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动有哪些信誉好的足球投注网站的结果也不尽相同。 。 三、模板制备 PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。当用RNA作模板时，首先要进行逆转录生成cDNA，然后再进行正常的PCR循环。大多数用途的PCR反应中，对DNA模板的要求并不严格。首先对纯度要求不严。大量的实验数据表明存在一定量的蛋白质，或SDS等对实验过程影响不大，所以只要没有交叉污染，模板DNA的制备可以不必像克隆、酶切、连接、标记等反应所用DNA制备那样严格。其次，模板用量很低，理论上102~104拷贝的模板是可满足各种要求的PCR反应。由于种种原因，准备的模板量要求达一定水平。一方面可减少由于实验操作和实验精确度方面等原因而引起的扩增失败，同时用作扩增的模板DNA量越多，由于交叉污染引起的反应失败的可能性小。 （一）DNA模板制备 去垢剂破坏细胞，除杂质，乙醇沉淀核酸 水煮沸溶解细胞 要求并不严格 模板用量低，哺乳动物基因组DNA1μg，质粒DNA0.1ng (二)RNA模板的制备 RNA提取试剂盒 酸性硫氰酸胍-酚-氯仿法 异硫胍氯化铯密度梯度分离法 SDS-酚-氯仿法 注意防止RNA水解 （三）模板的取材 病原体标本：病毒、细菌、真菌、螺旋体、立克次体、支原体等 病理生理标本：细胞、血液、绒毛、尿液等 法医学标本：血斑、精斑、毛发 考古标本 四、PCR基本反应 （一）以DNA为模板的反应 反应体积：50~100μl