5-4 基因克隆技术.pptVIP

1 RACE技术 1.1 RACE技术的简介 cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。 完整的cDNA 序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术获得。 末端克隆技术是20世纪80年代发展起来的。RACE (rapid-amplification of cDNA ends) 是一项在已知部分cDNA序列的基础上克隆5’和3’缺失（未知）序列的的技术。 分为5’ RACE和3’ RACE。 1.2 RACE的优点（了解） 与筛库法相比较，有许多方面的优点 1）此法通过PCR技术实现，无须建立cDNA文库，可短时间内获得有利用价值的信息。 2）节约了实验所花费的经费和时间。 3）只要引物设计正确，在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长。 1.3 RACE引物 RACE技术要求必须知道至少23－28个核苷酸序列信息，以此来设计5’末端和3‘末端RACE反应的基因特异性引物（GSPs）。 GSPs应该是： 23－28 nt 50－70％GC。这样可以使用降落PCR。避免使用自身互补性的引物序列；避免使用与AP1 （adaptor primer）互补的引物，尤其在3’末端。 65℃ ≤ Tm值≤ 70 ℃可以获得好的结果 需要实验者根据已有的基因序列设计5’和3’RACE反应的GSP。 1.5 RACE产物的验证 对RACE的片段进行验证，以确定是否已经扩增了目的产物。如果得到的是多条带或者研究的是多基因家族的成员，验证是非常有用的。 有3种验证RACE产物的方法： （1）比较由GSP和NGSP获得RACE产物。 （2）Southern blot （3）克隆并测序 建议最好测得RACE产物的部分序列。有的时候需要嵌套引物的存在。 2 cDNA差示分析法 抑制性差减杂交 (suppressive subtractive hybridization, SSH) 与PCR结合的快速分离差异基因的方法。 方法 分别提取实验组和对照组mRNA合成双链cDNA 选择能识别 4 碱基的限制性内切酶切割 分别连接2个接头 加温去掉12碱基短链 PCR 分别连接2个接头 加温去掉12碱基短链 PCR 优点：采用两次差减杂交和PCR，保证了高特异性 (假阳性率可降至6％)；在杂交过程中可使不同丰度基因均衡化，获得低丰度差异表达基因；操作相对简便，是目前分离新基因的主要方法 缺点：起始材料需要 ?g 级量mRNA; SSH差减克隆片段较小，获取cDNA全长序列有一定难度 Gateway大规模克隆技术 Gateway技术是基于已研究的非常清楚的λ嗜菌体位点特异重组系统。 在构建入门载体后，不再需 要使用限制性内切酶和连接酶。 TOPO反应和LR反应构成了 Gateway技术。 TOPO反应：将目的基因连接 入Entry载体。 Gateway大规模克隆技术 LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。 LR反应用来在平行的反应中转移目的序列从Entry载体重组入目的载体。 Entry载体：基因两端具有attL1和attL2位点。 目的载体：含有attR1和attR2位点。 LR反应是在重组蛋白的作用下发生定向重组，形成新的位点attB1和attB2。 Gateway大规模克隆技术 优点： Gateway技术大大简化了基因克隆和亚克隆的步骤，且典型的克隆效率高达95％或更高。 目的基因克隆入表达载体时，还可以保证正确的方向和阅读框。 基因图位克隆法 用于分离性状未知的目的基因。 步骤： 构建遗传连锁图，将目的基因定位到染色体的特定位点，并在其两侧确定特定的紧密连锁的遗传标记。 找出距离目的基因最近的两侧遗传标记，通过染色体步移技术将位于两个遗传标记内的目的基因克隆并分离出来。 差异显示技术(mRNA differential display reverse transcription chain reaction, DDRT-PCR) 思考题 简述基因克隆的技术的种类及其应用？ RACE技术原理？ cDNA法克隆目的基因的基本战略 mRNA cDNA第一链的合