实验五微生物的显微镜直接记数法.docVIP

实验六 酵母菌的血球计数板计数法数法 一、实验目的 学习血球计数板计数法使用的原理与方法，并学习区别死活酵母的方法。 二、基本原理 测定微生物数量方法很多，通常采用的有显微镜直接计数法、平板计数法、细胞和原生质体总量计测法等三类。 镜检计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌抱子可采用血球计数板；一般细菌则采用彼得罗夫?霍泽（Petroff Hausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，故细菌不易看清。 血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有4 条槽而构成3 个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网（图l8）。每个方格网共分9 大格，其中间的一大格（又称为计数室）常被用作微生物的计数。常见血球计数板的计数室有两种规格一种是16×25型，称为麦氏血球计数板，共有16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格。另一种是25×l6 型，称为希里格式血球计数板，共有25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但是不管哪种规格的血球计数板其计数室的每个大方格均由400个小方格组成（图19）。 每个大方格边长为1mm ，则每一大方格的面积为1mm2，每个小方格的面积为1/4000mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm，所以每个计数室（大方格）的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格（或中方格）中微生物的数量，再换算成每ml菌液（或每g样品）中微生物细胞的数量。 图18 血球计数板的构造 A、平面图（中间平台分为两半，各刻有一个方格网） B、侧面图（中间平台与盖玻片之间高度为0.1mm的间隙） 三、实验器材 1．菌种 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌悬液； 2．仪器 显微镜，血球计数板； 3．材料 盖玻片，吸水纸，尖嘴滴管。 4．染料 美兰染液 图19 血球计数板计数网的区分和细分格 四、操作步骤和内容 1．视待测菌液浓度，加无菌水作适当稀释，以每小格的菌数可数为度。应当稀释到每各中格大约30个左右的酵母，60-100左右的细菌。准确计算稀释倍数。 2．血球计数板使用前应当清洗干净，用95%酒精棉球擦洗，切勿用火焰烘干。取洁净的血球计数板一块，在计数室上盖上一块盖玻片。 3．将酵母菌液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的边缘滴入一小滴（不宜过多），使菌液沿两玻片间自行渗入计数室，勿使产生气泡，并用吸水纸吸去多余菌液，避免盖玻片上浮。也可以将菌液直接滴加在计数室上，然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。 4．静置约5min，先在低倍镜下找到计数室后，再转换高倍镜观察计数。 5．计数时用25中格的计数板，要按对角线方位，取左上、左下、右上、右下、中央的5个中格中的菌数。如果是16中格计数板，计左上、左下、右上、右下四格的菌数。由于菌体在计数室中处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因而观察时必须不断调节微调螺旋，方能数到全部菌体，防止遗漏。如菌体位于中格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。 6．凡酵母菌的芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复分数2-3次（每次数值不应误差过大，否则应重新操作），取其平均值，按下述公式计算出每ml菌液所含酵母菌细胞数。 式中A代表五个中格中的菌数，B代表菌液本身的稀释度 7．血球计数板用后，在水龙头上用水柱冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净自行晾干，或用滤纸沾干。最后用擦镜纸擦干净。若计数是病原微生物，则需先浸泡在5%的石炭酸溶液中进行消毒后清洁。 五、注意事项 1．加酵母菌液时，量不应过多，不能产生气泡。 2．由于酵母菌菌体无色透明，计数观察时应仔细调节光线。或者用吕氏碱性美蓝染液处理酵母菌液。美兰是一种弱的氧化剂，还原后变为无色，酵母细胞死活的鉴别就是利用美兰的这一特性。活的酵母细胞由于新陈代谢不断进行，能将美兰还原，而死的酵母细胞则不能，染色须严格控制时间。 六、实验结果 培养（ ）℃（ ）小时 稀释（ ）倍 七、思考题 1．血球计数板产生误差的主要原因在哪里？如何减少误差？ 2．采用血球计数板计数和平板菌落计数的主要差异在哪里？