分子生物学实验指导-第四次.docVIP

实验四 质粒DNA的限制性酶切 一、背景知识 酶切是基因操作的基本工具之一，在基因水平的改造过程中重要的意义。正确选择及恰当使用内切酶，将为基因改造提供便利的途径。酶单位：一个单位限制性内切酶是指在最合适条件下，在50 μl体积1小时内完全切开1 μg λ噬菌体DNA所需的酶量。限制性内切酶-20℃下保存。限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA序列位点上，并在此切割双链DNA。绝大多数限制性内切酶识别长度为6个核苷酸，不同的酶具有不同的切割位点。一些酶切割DNA双链产生平端的DNA片段，另一些酶则切割产生带有单链突出末端（即粘性末端）的DNA片段。限制酶在一些特定条件下使用时，对于底物DNA的特异性可能降低。即可以把与原来识别的特定的DNA序列不同的碱基序列切断，这个现象叫Star活性。Star活性出现的频率，根据酶、底物DNA、反应条件的不同而不同，可以说几乎所有的限制酶都具有Star活性。为防止Star活性的产生，将反应体系中的甘油含量，尽量控制在10%以下。37 ℃。酶切反应时间有30 分钟、60 分钟，以至2 小时以上甚至过夜。 使用两种酶同时进行DNA切断反应 (Double Digestion)，是实验操作中常用的手段之一。为了节省反应时间，通常希望在同一反应体系内进行。此时，Buffer非常重要。? 本次实验要进行的是对重组质粒分别进行单酶切和双酶切，从而验证质粒的正确性。 限制酶切反应后进行电泳时，有时会发生电泳带无法确认、电泳带扩散、电泳带移动距离异常等问题，这是由于酶蛋白自身或其它杂蛋白与DNA结合在一起，使DNA没有进入电泳凝胶中，或DNA难以被溴乙锭染色而造成的。发生这些现象时，在试样中加入一些蛋白质变性剂 (如SDS，终浓度0.1 %左右)，便可改善电泳效果。 × loading buffer就含有SDS成分。 三、实验目的 掌握酶切的原理及相关概念，熟悉酶切的基本方法和流程。 1、仪：台式离心机、恒温水浴锅、电泳仪及电泳槽、凝胶成像2、材料：质粒移液器、1.5ml离心管、吸头、3、试剂：内切酶、 × loading buffer、50 × TAE、蒸馏水 五、操作步骤 1、在1.5 ml 离心管管中依次加入以下相应试剂(20μl反应体系)： 单酶切 ddH2O 13.7 μl 10×buffer 2 μl 质粒DNA 4 μl 酶 0.3 μl 或双酶切 ddH2O 13.7 μl 10×buffer 2 μl 质粒DNA 4 μl 酶1 0.3 μl 酶2 0.3 μl 其中限制性内切酶最后加入，轻轻混匀，稍加离心。 2、37 ℃，水浴1 h。 3、电泳检测：1.2 %的琼脂糖凝胶电泳。 取质粒酶切产物15 μl ，加适当lodging buffer混匀上样，以未经酶切的质粒做对照。每组有一个泳道点加5 μl DNA ladder 。 采用5 V/ cm的电压，使DNA分子从负极向正极移动，至合适位置取出并在EB溶液中染胶5 min左右，用凝胶成像仪照相。 六、实验结果与报告 请记录你所提取的质粒DNA酶切结果，并作分析。 七、附件(TaKaRa双酶切通用缓冲液)