重组人胰岛素制备工艺中大肠杆菌破碎方法选择 毕业论文.docVIP

重组人胰岛素制备工艺中大肠杆菌破碎方法选择 Recombinant human insulin production process E. coli broken method choice 1摘要 重组人胰岛素的生产，目前通过重组基因工程菌的发酵，以菌体的代谢，来合成人胰岛素[1]。所应用的工程菌种一般是大肠杆菌类，其目标蛋白在胞内表达，形成包涵体。一般生产工艺流程是通过目标基因的提取，制备工程菌，通过发酵扩大培养（形成大量的菌体），再通过浓缩，洗菌，破碎，复性，纯化，结晶，再结晶，冻干，收集晶体等步骤。其中菌体破碎是提取胞内产物的关键性步骤。其破碎率的大小，将直接影响一下工艺中的最终胰岛蛋白的得率。所以，提高菌体破碎率，将会提高包涵体的收集，有利于提高胰岛素的得率。 大肠杆菌再生产过程中，由于其质粒引入的人胰岛素基因是外援基因，且大肠杆菌是原核生物，目标蛋白是胞内表达，并形成水不溶性的包涵体。 细胞破碎的目的是释放出细胞内含物（包涵体），其方法很多，按照是否存在外加作用力可分为机械法和非机械法。机械法（高压匀浆器、高速珠磨机、超生波振荡器等）；非机械法（酶解法、渗透压冲击法、冻结-融化法、化学法等）文献综述[2]，所以要进行菌体破碎，才能获得包涵体。 包涵体形成的原因：研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体[3]。所形成的包涵体可能是因为蛋白合成过快，以至于没有足够的时间进行有效的空间折叠，无法形成有活性的蛋白。重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，真核蛋白无法糖基化使中间体溶解度下降，导致不溶解包涵体形成。有报道认为，丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体[4]。 工程菌大肠杆菌的细胞壁：大肠杆菌是革兰氏阴性菌，其细胞壁位于菌体最外层，厚约11um，分为两层，即外膜和肽聚糖层。外膜是大肠杆菌细胞壁的主要成分，占细胞壁于重的80％，厚约8nm，位于肽聚糖层的外侧，主要由磷脂、蛋白质和脂多糖组成。nm，占细胞壁成分的10%左右，肽聚糖之间仅由四肽侧链直接连接，缺乏五肽桥，故层较疏松，且肽聚糖居于细胞壁最内层，紧贴于细胞膜上[5]。细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，其网状结构的致密程度和强度取决于多糖链上所存在的肽键数量和其交联的程度。交联程度越大，网状结构就越致密，破碎的难度也就越大。 2.2破碎方法介绍与分析（细胞破碎的方法可分为两种：即机械法和非机械法） 2.2.1机械法： ⑴高压匀浆器（high pressure homogenizer），高压匀浆器是常用的破碎装置。其工作原理： 高压匀浆器又名高压匀浆机、高压均化机、高压乳化泵。它是一种用途广泛的破碎、乳化设备。高压匀浆器一般有一个或几个往复运动的柱塞。一半多柱塞的往复泵其一对一的对应各自的工作室，个工作室互不相连，但进料管和排料管相通。个工作室并联在一起，做往复运动。依靠着柱塞的运动的配合，各单向阀门把处理的物料吸入泵腔内进行高压压缩。一般最高可达10000Kg／CM2，这些被压缩的物料经过一个或几个可调节的限制阀口，以很高的线速度由阀口喷出。撞击在特殊材料制成的圆环上，产生了三种效应： 第一是空穴效应，被柱塞压缩的料液高压物料的内部产生了很大的能量，料液通过阀口时，突然失压，物料内部的巨大能量被释放出来，形成气泡，引起空穴爆炸，形成空穴效应； 第二是碰撞效应，通过阀口的物料有极高的流速，这些高速喷射的物料将会强烈的撞击在一个坚硬的圆环上，产生破碎； 第三个效应是剪切效应，物料通过泵腔内的通道和阀口的狭缝时会产生剪切效应，另外由于混悬液各流层之间的流速不同，各层之间还会产生内部的剪切。通过这三种效应，高压匀浆器能使物料达到很高的破碎率。 影响高压匀浆器破碎的主要因素是压力、温度和通过匀浆器的次数。一般来说，增大压力和增加破碎次数都可以提高破碎率，但当压力增大到一定程度后对匀浆器的磨损较大。Brokman等人[6]已研究了能适应于高压操作的匀浆阀，试验表明在约175Mpa的压力下，破碎率可达100%，但也有试验表明，当压力超过一定值后，破碎率的增加很慢[7]。工业生产中，通常采用的压力55~70Mpa。 高压匀浆器适用范围广，可以在大规模处理料液时采用；细化作用强烈，且细化作用是利用了物料间的相互作用，物料间的发热量较小。因而，可以维持一些成分的性能基本不变；高压匀浆器是通过往复泵送料，在正常运行中能够定量的输送物料；噪音一般较小；高压匀浆器耗能较大；高压匀浆器的阀件、密封件、柱塞等较易损毁；高压匀浆器不适合用于黏度很高的料液处理；一些交易造成团状或丝状的真菌，以及较小的革兰氏阳性菌不适于用高压匀浆器处理；高压匀浆器的运行参数少，易于确定，而且物料损失量少，最少可处理20ml悬浮液[8]。 ⑵高速珠磨机（high